人KCNJ15基因真核表達質(zhì)粒的構建及其體外功能研究.pdf

1、研究背景及目的:重型肝炎病情兇險，死亡率極高，發(fā)病機制極為復雜。本研究室前期利用基因芯片技術研究發(fā)現(xiàn)，較乙型慢性輕度肝炎（CHB）患者，KCNJ15基因在乙型重型肝炎（SHB）患者外周血單個核細胞（PBMC）表達顯著上調(diào)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，KCNJ15在乙型重型肝炎（SHB）患者外周血CD4+T細胞和CD8+T細胞表達顯著上調(diào)，尤其以CD4+T細胞更為顯著。本研究的目的在于構建人KCNJ15真核表達質(zhì)粒，通過體外轉(zhuǎn)染人急性T淋巴細胞白血

2、病T淋巴細胞(Jurkat細胞)，探討Jurkat細胞的功能變化，以探討KCNJ15在乙型重型肝炎（SHB）發(fā)生發(fā)展過程中的免疫致病作用。
　　 研究方法:收集乙型重型肝炎患者外周血，分離PBMC后提取RNA，以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,通過設計的KCNJ15特異性引物擴增其全長開放閱讀框序列（ORF），利用分子克隆技術構建KCNJ15真核表達質(zhì)粒，測序明確序列正確性。利用電轉(zhuǎn)染的方法將KCNJ15真核表達質(zhì)粒導入Jurkat細

3、胞，分別利用Real-time PCR和Western blot法檢測基因和蛋白質(zhì)水平的表達。檢測轉(zhuǎn)染后Jurkat細胞表面活化分子CD25、CD69的表達及細胞因子的分泌情況。
　　 研究結果:成功的構建了人KCNJ15真核表達質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染Jurkat細胞系。轉(zhuǎn)染KCNJ15真核表達質(zhì)粒后，Jurkat細胞表面活化標志未見明顯改變，Jurkat細胞的細胞因子IL-17A的表達上調(diào)、IL-9的表達下調(diào)。
　　 研究結論:成