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文檔簡介
1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 胰島素基因轉(zhuǎn)錄由胰島素啟動(dòng)子引發(fā),在這個(gè)過程中有許多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與,通過提高體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)量,從而提高胰島素基因的轉(zhuǎn)錄是一種可能有效的途徑。肌腱膜纖維肉瘤腫瘤基因同系物A(Mus musculus v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family,protein A,MafA)是最近分離出來的轉(zhuǎn)錄因子,具有胰腺β細(xì)胞特異性,對(duì)于胰腺生長和β細(xì)胞(產(chǎn)生胰島素
2、的細(xì)胞)的分化及維持正常的β細(xì)胞功能至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建可以表達(dá)小鼠MafA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞HePG-2,觀察MafA基因在細(xì)胞中的表達(dá),為進(jìn)一步研究MafA功能及其作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.提取小鼠胰腺總RNA,經(jīng)RT-PCR獲得MafA基因片段,并在兩端分別引入HindⅢ和SalⅠ酶切位點(diǎn),重組至有增強(qiáng)綠色熒光蛋白標(biāo)記的真核表達(dá)載體pEGFP-N2,pEGFP-C1中。 2
3、.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞HePG-2細(xì)胞中,再通過三種不同葡萄糖濃度刺激已轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞,用熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá),通過RT-PCR檢測(cè)MafA基因和insulinⅡ基因的表達(dá),通過WesternBlot檢測(cè)融合蛋白EGFP-MafA的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.通過RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒時(shí),在1080bp獲取了明亮的條帶?;驕y(cè)序測(cè)得所獲得得基因序列與GENEBANK報(bào)道MafA基因序列一致。 2.轉(zhuǎn)
4、入重組質(zhì)粒的細(xì)胞有綠色熒光蛋白表達(dá)。Western Blot檢測(cè)重組質(zhì)粒表達(dá)時(shí)在70KD左右可見明顯的條帶。 3.通過RT-PCR檢測(cè)insulinⅡ表達(dá)時(shí),沒有得到目的條帶。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論: 1.利用帶有綠色熒光蛋白序列為報(bào)告基因的pEGFP-N2和pEGFP-C1,成功構(gòu)建了可表達(dá)融合基因EGFP-MafA的真核表達(dá)質(zhì)粒。pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA。 2.pEGFP-N2/Ma
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