SAMP8小鼠海馬神經元凋亡與線粒體融合蛋白Mfn1-Mfn2的表達及SS31肽的保護作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是以進行性記憶和認知功能下降為主要表現(xiàn),伴有人格和行為異常的年齡相關的常見神經變性病。AD病人的病理改變主要有Aβ炎性斑、過度磷酸化的Tau蛋白形成神經原纖維纏結、線粒體/突觸結構和功能改變及神經元減少。其發(fā)病機制有能量代謝假說、氧化應激假說、淀粉樣蛋白(amyloid)級聯(lián)反應假說、膽堿能假說等,但其具體機制尚未完全闡明。AD的發(fā)病率正逐年增長,給越來越多的AD病人及其家庭的

2、生活、工作造成不便。目前最常用的AD模型為快速老化模型SAMP8模型。
  實驗顯示AD與氧化應激及線粒體功能異常有關。ROS主要在線粒體產生,并主要作用于線粒體,使線粒體數量減少,引起神經元一系列變化,促進細胞死亡。神經細胞組成成分被過度氧化時,調節(jié)凋亡的相關蛋白表達水平發(fā)生改變,促進凋亡的發(fā)生。對神經元的凋亡有調控作用的因子有:Caspase家族、線粒體融合基因和分裂基因表達及Bcl-2家族等。凋亡相關蛋白Bcl-2家族中Bc

3、l-2能抑制凋亡,Bax能促進凋亡。Mfn1、Mfn2為線粒體融合基因。研究顯示,融合基因表達在大多數嚴重的AD病人中下降較為明顯,其中Mfn1下降最明顯。融合基因表達減少使線粒體數量減少,ATP形成障礙,神經元變性,促進AD的發(fā)生。抗氧化劑的應用可抑制氧化應激,減輕線粒體結構破壞和功能障礙,減少細胞凋亡,改善AD病人的認知功能。SS31是一種抗氧化四肽,大多位于線粒體內膜。研究顯示,它能減少線粒體活性氧產生、清除活性氧、抑制脂質等物質

4、過氧化、抑制線粒體通透性改變、保護線粒體功能、減少細胞死亡,SS31對與細胞氧化損傷及線粒體功能障礙有關的各種神經變性病有效。
  目的:觀察快速老化模型SAMP8(senescence-accelerated mouse prone8)小鼠和SAMR1(senescence accelerated mouse resistant1)小鼠海馬神經元內融合蛋白Mfn1(Mitofusin1)和Mfn2(Mitofusin2)表達及凋

5、亡相關蛋白Bcl-2(B-cell lymphoma-2)和Bax(Bcl-2 Assaciated(X) protein)表達情況;探討線粒體靶向抗氧化肽SS31對中樞神經系統(tǒng)(Central nervoussystem CNS)是否有保護作用;并為抗衰老及AD的防治提供新的理論指導。
  方法:
  1.實驗動物及分組選取8月齡健康雄性SAMR1小鼠和SAMP8小鼠,將SAMP8小鼠隨機分為三組,第一組不予干預為P8模型

6、對照組(Model group),第二組注射生理鹽水5mg/kg/d為溶媒對照組(Vehicle group),第三組腹腔注射SS315mg/kg/d為SS31處理組(SS31)。SAMR1小鼠注射生理鹽水5mg/kg/d為R1正常對照組(Normal control group),實驗動物共分為四組。
  2.HE染色
  小鼠干預完畢后冰上斷頭取腦,于鼠腦視交叉至上丘之間的部位切取5um海馬標本。應用HE染色技術染色,在

7、光鏡下四組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)病理學變化。
  3.免疫組化
  小鼠干預完畢后冰上斷頭取腦,于鼠腦視交叉至上丘之間的部位切取5um海馬標本。應用免疫組化技術,在光鏡下觀察四組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)內Bcl-2、Bax蛋白表達情況。
  4.電鏡技術
  小鼠干預完畢后冰上斷頭取腦,于鼠腦視交叉至上丘之間的部位分離出海馬組織,切成1×1×1mm的組織塊,用4%戊二醛固定,電鏡技術檢測。
  5.蛋白印

8、跡
  小鼠干預完畢后冰上斷頭取腦,將海馬迅速分離出來,提取海馬總蛋白,用Western Blot技術定量檢測海馬中Mfn1、Mfn2蛋白含量變化。
  結果:
  1.HE染色
  SAMR1正常對照組海馬CA1、CA3區(qū)神經元細胞邊界、輪廓清晰,排列整齊、致密,核仁顯示明顯,胞核無固縮;P8模型對照組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經元細胞減少且雜亂,核仁顯示不清楚、甚至消失,核固縮;SS31處理組小鼠海馬CA1、

9、CA3區(qū)細胞較溶媒對照組細胞邊界、核仁稍清晰,胞核固縮、細胞數減少改善,但沒有恢復到SAMR1正常對照組水平。
  2.免疫組化
  2.1 Bcl-2蛋白表達Bcl-2蛋白主要在海馬CA1、CA3區(qū)神經元細胞胞漿表達,陽性細胞為淺黃色或黃褐色,背景染色較淺。P8模型對照組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)陽性神經元細胞較SAMR1正常對照組減少,SS31處理組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)陽性神經元細胞較溶媒對照組增多,但沒有恢復到SAM

10、R1正常對照組水平。陰性對照切片無陽性細胞。
  2.2 Bax蛋白表達Bax蛋白主要在海馬CA1、CA3區(qū)神經元細胞胞漿表達,陽性細胞為淺黃色或黃褐色,背景染色較淺。P8模型對照組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)陽性神經元細胞較SAMR1正常對照組增多,SS31處理組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)陽性神經元細胞較溶媒對照組減少,但沒有恢復到SAMR1正常對照組水平。陰性對照切片無陽性細胞。
  3.透射電鏡
  SAMR1小鼠以正

11、常神經元為主,很少見典型的凋亡細胞。SAMP8模型對照組小鼠海馬組織細胞減少,排列雜亂。海馬神經元凋亡樣改變增多,胞漿內線粒體輕度腫脹,并出現(xiàn)較多空泡,部分僅見細胞輪廓。SS31處理組小鼠海馬神經元較溶媒對照組細胞數量增多,神經元細胞、線粒體變化較輕,但沒有恢復到SAMR1正常對照組水平。
  4.蛋白印跡
  4.1 Mfn1蛋白的表達與SAMR1正常對照組相比,P8模型對照組Mfn1蛋白表達降低(P<0.05); SS3

12、1處理組與溶媒對照組相比,Mfn1蛋白表達增高(P<0.05),但與SAMR1正常對照組相比仍降低(P<0.05)。溶媒對照組和P8模型對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
  4.2 Mfn2蛋白的表達與SAMR1正常對照組相比,P8模型對照組Mfn2蛋白表達降低(P<0.05); SS31處理組與溶媒對照組相比,Mfn2蛋白表達增高(P<0.05),但與SAMR1正常對照組相比仍降低(P<0.05)。溶媒對照組和P8模型對

13、照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
  結論:
  1.在SAMP8小鼠中,海馬神經細胞減少,細胞及線粒體形態(tài)異常,Bax蛋白表達增多,Bcl-2蛋白的表達降低。線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2表達降低。提示SAMP8小鼠中細胞凋亡增加,線粒體動力學失衡與神經細胞損傷有關。
  2.在SS31干預下,海馬神經細胞和線粒體異常有所恢復,海馬神經細胞Bax蛋白表達降低,Bcl-2蛋白的表達增多;線粒體融合蛋白Mfn1和

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