線粒體Miro1蛋白對無鎂致癇海馬神經元氧化應激損傷的保護作用.pdf

1、背景與目的：
　　癲癇（epilepsy,EP）是常見的神經系統(tǒng)疾病，目前尚未明確癲癇的具體發(fā)病機制，抗癲癇藥物不能控制疾病的進展，終止癥狀使大腦對反復癇性發(fā)作更敏感，隨著時間的進展這種敏感性更加嚴重，這就要求我們進一步研究癲癇的發(fā)病機制，為癲癇治療尋找新靶點。
　　線粒體對神經遞質合成、鈣穩(wěn)態(tài)、氧化還原反應、活性氧的產生與調節(jié)以及神經元凋亡起關鍵作用，線粒體功能障礙導致癲癇發(fā)作過程中氧化應激增加，損傷線粒體DNA，引起脂質

2、過氧化，影響ATP利用，這些反應對抗內源性抗氧化機制的保護作用，導致神經網絡重組、神經元丟失、神經干細胞移位，最終導致癲癇發(fā)作，破壞這一過程對研發(fā)新型抗癲癇藥物阻止癲癇發(fā)作非常關鍵。Miro1介導的線粒體移動通過不斷清除受損線粒體，將正常功能線粒體運輸至作用部位，維持線粒體正常功能，對神經元發(fā)揮保護作用。因此癲癇發(fā)作過程中Miro1介導的線粒體移動有可能為臨床上治療癲癇提供新思路。
　　Miro是線粒體外膜Rho GTPase家族

3、的一員，它通過適配器蛋白（如Milton蛋白）與馬達分子（如驅動蛋白Kinesin）相連接。果蠅中Milton蛋白是首先被確定的將Miro蛋白與馬達分子鏈接的適配器蛋白。線粒體通過膜受體蛋白Miro連接適配器招募馬達分子。這些馬達分子/受體/適配器復合體確保目標線粒體的運輸，精確調節(jié)它們的分配以應對神經元活動的改變。最新研究表明果蠅中Miro既調節(jié)軸突中線粒體的順向運輸，也調節(jié)逆向運輸。果蠅中Miro突變損害線粒體運輸至神經元遠端區(qū)域，

4、最終導致軸突和突觸的線粒體消耗殆盡。
　　神經元有絲分裂后期的細胞經歷與機體相同的生命周期，當機體老化或者功能紊亂時需要線粒體不斷移動至作用部位來補充能量。神經元發(fā)生應激反應或完整性受到破壞時線粒體會不斷改變運動來保證神經元的正?；钚浴Ｒ虼苏{節(jié)線粒體運輸對滿足新陳代謝需求的變化、移除老化及受損線粒體、補充正常功能線粒體至神經末梢至關重要。此次研究運用Sombati法，通過無鎂細胞外液誘導海馬神經元體外癲癇模型，并構建腺病毒真核表達

5、質粒干預 Miro1表達，通過免疫蛋白印跡等多種方法檢測ND6、MDA及GSH表達水平的變化，探討Miro1對致癇海馬神經元氧化應激產生的影響，進一步明確能否通過調控線粒體移動發(fā)揮致癇神經元的保護作用。
　　方法：
　　將出生24小時內的Sprague-Dawley大鼠，斷頭后剝離雙側大腦組織，然后置于磷酸鹽緩沖液（PBS）培養(yǎng)皿中，剝離雙側海馬組織，并制成單細胞懸液接種于培養(yǎng)板中進行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)至14d的海馬神經元隨機分

6、為對照組（CON）、無鎂誘導組(AE)、AE+對照腺病毒轉染組(AE+rAdv)、AE+靶向 Miro1基因的shRNA重組腺病毒轉染組(AE+rAd-Miro1-shRNA)。CON組與AE組分別用正常含鎂細胞外液及無鎂細胞外液培養(yǎng)3h后更換為維持液培養(yǎng)。AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1-shRNA組于無鎂誘導48h前分別轉染不表達任何外源基因的對照腺病毒載體（rAdv）、靶向Miro1基因的shRNA重組腺病毒真核表達質粒

7、（rAd-Miro1-shRNA）,并于造模24h后終止細胞培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。通過倒置相差顯微鏡觀察海馬神經元特征，神經元特異性烯醇化酶（NSE）染色鑒定海馬神經元純度，采用Western blot法檢測細胞內Miro1、ND6蛋白的表達，免疫熒光法檢測細胞內ND6表達，比色法測定MDA、GSH的表達。
　　結果：
　　神經元形態(tài)學特征倒置相差顯微鏡下觀察到培養(yǎng)至7天時海馬神經元體積變大，胞體成錐形，樹突及軸突清晰可見，細

8、胞之間具有緊密聯(lián)系。
　　神經元純度測定神經元特異性烯醇化酶NSE染色鑒定，培養(yǎng)至7天時海馬神經元純度為90％以上。
　　Miro1蛋白表達情況與CON組比較，AE組、AE+rAdv組Miro1表達升高，差異均具有統(tǒng)計學意義，P<0.05；AE+rAd-Miro1-shRNA組Miro1表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。與AE組比較，AE+rAdv組Miro1表達升高，差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05；AE+rAd-

9、Miro1-shRNA組Miro1表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。
　　ND6蛋白表達情況：
　?。?）Western Blot法：與CON組比較，AE組、AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1-shRNA組ND6表達降低，差異均具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。與AE組比較，AE+rAdv組 ND6表達降低，差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05；AE+rAd-Miro1-shRNA組ND6表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義

10、，P<0.05。
　　（2）免疫熒光法：免疫熒光染色顯示，細胞質呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。運用ImageProPlus（IPP）圖像處理分析軟件分析，以累積光密度IOD（integrated optical density）作為胞質內ND6蛋白的相對表達量，其結果與Western Blot法檢測ND6蛋白表達情況一致。
　　MDA蛋白表達情況與CON組比較， AE組、AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1-shRNA

11、組MDA表達升高，差異均具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。與AE組比較，AE+rAdv組 MDA表達升高，差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05；AE+rAd-Miro1-shRNA組MDA表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。GSH蛋白表達情況與CON組比較，AE組、AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1-shRNA組GSH表達降低，差異均具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。與AE組比較，AE+rAdv組 GSH表達降低，差異無統(tǒng)計學意義，P

12、>0.05；AE+rAd-Miro1-shRNA組GSH表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。
　　結論：
　　1．致癇神經元Miro1蛋白反應性升高，ND6蛋白降低，MDA蛋白升高， GSH蛋白降低，提示Miro1介導的線粒體移動參與癲癇病理過程，致癇后海馬神經元產生氧化應激損傷。
　　2．轉染rAd-Miro1-shRNA病毒后，致癇神經元Miro1蛋白明顯降低，ND6蛋白進一步降低，MDA蛋白進一步升高，G