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文檔簡介
1、棉酚具有顯著的抗男性生育效果,其作為男性避孕藥的研究己經(jīng)進行了將近三十年。國內(nèi)外對棉酚和有關化合物作為避孕藥的作用機理、體內(nèi)代謝、毒性和臨床效果等方面進行了廣泛系統(tǒng)的研究,但至今其具體作用機制目前仍不清楚。
鑒于以上原因,研究棉酚的男性抗生育機制是男科學一項十分有意義的工作。
支持細胞(Sertoli cell )是雄性哺乳動物睪丸曲細精管內(nèi)唯一的體細胞,可以維持和調(diào)節(jié)正常的生精過程,在精子發(fā)育成熟的過程中具
2、有極為重要的作用。
Sertoli 細胞的結構和功能的完整性對生精細胞的增殖和成熟十分關鍵,其改變可導致生精細胞的脫落和死亡。
間隙連接(gap junction,GJ)是位于細胞胞膜上連接相鄰細胞間的通路,允許小分子及離子物質(zhì)交換,其主要生化成分為連接蛋白(connexin,Cx)。睪丸中最主要的連接蛋白是connexin43(Cx43),主要位于曲細精管的基底層Sertoli 細胞之間的血睪屏障以及Ser
3、toli 細胞和生精細胞之間。
近期有多個文獻報道,林丹、鎘等毒素能減少Sertoli 細胞的連接蛋白,并使Sertoli 細胞上Cx43 的數(shù)量減少,從而影響間隙連接通訊(GJIC)的功能,進一步影響到睪丸Sertoli 細胞在精子發(fā)生過程的正常功能,并對睪丸腫瘤的發(fā)生可能也有影響。因此,我們推測棉酚對雄性生殖功能的影響可能也首先從Sertoli 細胞開始。
本實驗的目的是研究棉酚對睪丸支持細胞的毒性作用,
4、檢測支持細胞的間隙連接功能,進一步探討棉酚作用下睪丸支持細胞膜上間隙連接蛋白表達的變化,從而明確棉酚對支持細胞間隙連接的影響。對于研究棉酚的抗生育作用具有重要意義,對于我們進一步開發(fā)低毒性男性避孕藥有指導意義,同時也可為研究其他環(huán)境毒性物質(zhì)機理提供新思路。
在課題的第一部分,采用TM4 細胞株,通過CCK-8 實驗確定棉酚染毒劑量,選定不同濃度(1.25,2.5,5,10 μmol/L )棉酚分別處理細胞(6,12,24
5、,48h ),應用劃痕標記熒光染料示蹤技術檢測Sertoli 細胞GJIC 的功能變化,進一步采用RT-PCR 、western blot 及細胞免疫熒光法分別從RNA 水平、蛋白表達水平及細胞分布變化來探討棉酚對支持細胞間隙連接的影響。課題的第二部分,改進睪丸支持細胞的分離方法,在體外分離培養(yǎng)小鼠睪丸支持細胞。分別用Feulgen 染色法及檢測Fas -L 表達等方法來鑒定支持細胞的純度,并用RT-PCR 檢測棉酚對原代培養(yǎng)的支持細胞
6、上間隙連接的影響。課題第三部分,給成年雄性小鼠胃飼15mg/kg/d 棉酚后分別觀察4 周、8 周及12 周睪丸的曲細精管,免疫組織化學方法檢測支持細胞上間隙連接的變化。
實驗結果表明,棉酚對TM4 細胞有抑制作用。當棉酚濃度<10 -5 mol/L 時,細胞存活率大于90%,對TM4 細胞的存活率無明顯影響;濃度>5 ×10 -4 mol/L 時,對Sertoli 細胞存活率的影響隨著劑量增大而降低,并呈劑量-效應關系,
7、EC50 為1.5×10 -5 mol/L 。當棉酚濃度為5 ×10 -3 mol/L 時,存活率明顯降低,細胞存活率<3%,其差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。5 μmol/L 棉酚作用TM4 支持細胞24 小時結果與空白對照組比較,2mm 長度內(nèi)劃痕兩側綠色熒光負載細胞數(shù)目,空白對照組細胞數(shù)為1079.3 ±290.0 ,棉酚組為305.6 ±134.2 。組間差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05),提示棉酚用藥后TM4 細胞間隙連接
8、功能明顯下降。5 μmol/L 棉酚分別作用TM4 支持細胞6 小時,12 小時,24 小時及48 小時后RT-PCR 結果提示Cx43 mRNA 在各組細胞中均有表達,但隨棉酚處理時間增加而逐漸下降。與空白組相比,24 小時組與48 小時組Cx43 mRNA 的量均顯著下降(P<0.05)。1.25,2.5,5 及10 μmol/L 棉酚分別處理TM4 支持細胞24 小時后Westernblot 結果提示Cx43 蛋白在各劑量組均有表
9、達,但表達量隨濃度的增加逐步下降,5 μmol/L 及10 μmol/L 組中的表達量均明顯低于空白組(P <0.05 )。1.25,2.5 及10 μmol/L 棉酚作用TM4 支持細胞24 小時后行免疫熒光細胞化學結果可見,棉酚作用組與對照組表達相比較,陽性率和表達強度較正常組均降低,且隨劑量增加Cx43 蛋白熒光表達強度逐漸減弱。1.25 μmol/L及2.5 μmol/L 組Cx43 表達陽性率和表達強度均明顯降低,未見有強陽性
10、表達,10μmol/L 組只有極少部分為弱陽性表達,位于細胞漿,呈淡綠色斑點狀,未見位于細胞膜。在實驗的第二部分,成功分離了的原代的小鼠睪丸支持細胞,純度可達85%以上,RT-PCR 分析提示棉酚對其也存在抑制間隙連接蛋白的作用。實驗的第三部分,對小鼠進行15 mg/kg/d 劑量棉酚處理實驗表明,胃飼棉酚4 周小鼠睪丸曲細精管的形態(tài)無明顯改變,但從8 周開始,支持細胞膜上的間隙連接蛋白的表達減少,12 周時間隙連接蛋白明顯減少,提示棉
11、酚對睪丸支持細胞連接蛋白的表達有抑制作用。由此我們得出結論,正常Sertoli 細胞存在大量間隙連接通訊,主要成分為Cx43 。棉酚能抑制Sertoli 細胞的間隙連接通訊功能,而細胞上Cx43 表達的減少是其功能受損的物質(zhì)基礎。低劑量棉酚處理小鼠,曲細精管上皮周期頻率沒有明顯紊亂,精子發(fā)生過程沒有被嚴重破壞,預示了其作用的可逆性。但其可損傷睪丸Sertoli 細胞上Cx43 的表達,進而可影響小鼠睪丸Sertoli 細胞的功能,為棉酚
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