脫落酸（ABA）結(jié)合蛋白基因克隆、表達(dá)及其產(chǎn)物對(duì)ABA的特異結(jié)合.pdf

1、脫落酸(adscisic acid,ABA)作為一種植物激素,已證實(shí)不僅在調(diào)控植物休眠、衰老和果實(shí)發(fā)育等諸多過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用,而且,在植物對(duì)干旱、低溫、鹽堿等逆境脅迫的反應(yīng)中起著共同調(diào)節(jié)因子的作用.在ABA到達(dá)作用位點(diǎn)后,ABA應(yīng)答反應(yīng)的第一步是一系列的細(xì)胞信號(hào)感知和識(shí)別,其中,ABA受體對(duì)原初信號(hào)的識(shí)別起著關(guān)鍵的作用.利用ABA類似物能夠激活不同的應(yīng)答途徑,推測(cè)在植物不同的組織結(jié)構(gòu)中存在多種的ABA受體.盡管,通過(guò)遺傳學(xué)、生物

2、化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)方法,ABA結(jié)合蛋白的研究取得了巨大的進(jìn)展.但是,遺憾的是至今仍然還未鑒定出任何可能的ABA受體.因此,真正意義上的ABA受體確定仍待做大量的工作.近年來(lái),我室利用親和層析從蠶豆上表皮中分離出一種高親合、高度特異性的ABA結(jié)合蛋白,并完成了對(duì)其生化特性深入分析及部分測(cè)序,且在一定程度上揭示了該蛋白與ABA的生理功能效應(yīng)存在著內(nèi)在的聯(lián)系,這為進(jìn)一步克隆ABA結(jié)合蛋白基因奠定了堅(jiān)實(shí)的工作基礎(chǔ).該研究是在此基礎(chǔ)上以基于測(cè)序的部

3、分氨基酸序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并寡核苷酸為擴(kuò)增引物,結(jié)合RT-PCR和RACE技術(shù)從蠶豆幼葉中克隆得到了兩個(gè)全長(zhǎng)的cDNA序列,并建立了該基因甲醇酵母高效表達(dá)體系,通過(guò)ProBond resin鎳親和層析一次可純化出毫克級(jí)表達(dá)蛋白,為ABA結(jié)合蛋白生理功能的進(jìn)一步鑒定邁出了堅(jiān)實(shí)的一步.3′-/5′-RACE擴(kuò)增片段序列分析結(jié)果表明,ABP370擴(kuò)增片段的全長(zhǎng)cDNA為3449核苷酸,其中5′非翻譯區(qū)為876個(gè)核苷酸,3′非翻譯區(qū)為369個(gè)核苷酸并

4、末端帶Poly(A)尾巴,從起始密碼子ATG至終止密碼子TGA,含有一個(gè)編碼768個(gè)氨基酸殘基的開(kāi)放閱讀框架(2304bp);ABP640擴(kuò)增片段的全長(zhǎng)cDNA為1012核苷酸,其中5′非翻譯區(qū)為88個(gè)核苷酸,3′非翻譯區(qū)為144個(gè)核苷酸并末端帶Poly(A)尾巴,從起始密碼子ATG至終止密碼子TAA,含有一個(gè)編碼260個(gè)氨基酸殘基的開(kāi)放閱讀框架(780bp).利用PCR技術(shù)將上述兩個(gè)全長(zhǎng)cDNA的編碼區(qū)克隆到表達(dá)載體pMETα上,使之

5、位于α因子信號(hào)肽序列的下游,6個(gè)組氨酸殘基序列的上游,且與之同框,分別構(gòu)建成融合蛋白分泌表達(dá)載體pMET α B/ABP2304和pMET α A/ABP780.通過(guò)LiCI化學(xué)轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的重組質(zhì)粒插入到甲醇酵母PMAD16菌株的染色體上.篩選Ade+表型轉(zhuǎn)化子,20ml BMMY搖瓶培養(yǎng),用0.5％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)5天后,SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明:選出的重組高效表達(dá)菌株P(guān)MAD16/pMET α B/ABP2304和PMAD16/p