十二指腸鉤蟲錳超氧化物岐化酶(AdMn-SOD)的生物信息學分析、表達及其活性研究.pdf

1、[目的]
　　 本論文在課題組前期分離獲得十二指腸鉤蟲錳超氧化物岐化酶(AdMn-SOD)基因序列的基礎上,對推導的AdMn-SOD氨基酸序列進行生物信息學分析;進一步構建AdMn-SOD成熟蛋白原核表達系統(tǒng),在大腸桿菌(E.coli)中融合表達AdMn-SOD,并分析純化的重組AdMn-SOD的活性及溫度、pH值對活性的影響。研究結果將為進一步研究AdMn-SOD的生物學功能并探討其應用奠定基礎。
　　 [方法]

2、>　　 1.AdMn-SOD的生物信息學分析
　　 運用生物信息學軟件DNASTAR及DNAMAN分析前期獲得的AdMn-SOD基因序列的閱讀框(ORF);運用在線軟件SignalIP3.0及TargetP program(http://www.cbs.dtu.dk/services)分別預測推測的AdMn-SOD的信號肽序列及其亞細胞定位;運用在線生物信息學軟件BLAST搜索AdMn-SOD基因序列及其推導的氨基酸序列在Ge

3、nBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的同源性序列;在www.expasy.ch/Tools/protparam.html中分析推測的AdMn-SOD理化性質;在http://npsa-pbil.ibcp.fr上選用HNN法對推測的AdMn-SOD的二級結構和折疊類型進行預測;在http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterproSCAN/中搜索推測的AdMn-SOD的功能域;運用CLU

4、STAL W程序比對分析AdMn-SOD與其它已報道線蟲及部分代表性物種的Mn-SOD氨基酸序列;運用MEGA3.1軟件中鄰近法(neighbor-joining method)分析基于Mn-SOD氨基酸序列的AdMn-SOD與其它線蟲及部分代表性物種Mn-SOD的進化樹關系。
　　 2.AdMn-SOD的原核表達
　　 設計引物,擴增 AdMn-SOD成熟蛋白編碼序列,擴增產物經 BamH I和HindⅢ雙酶切后與表達

5、載體pET-32a連接,構建重組原核表達重組質粒。將構建好的重組表達質粒pET-32a/AdMn-SOD轉化至大腸桿菌BL21(DE3),經IPTG誘導表達,SDS-PAGE分析表達情況。
　　 3.重組AdMn-SOD的活性檢測
　　 誘導表達的重組蛋白用Ni親和層析進行純化,用Bradford法測定純化蛋白的濃度,用超氧化物岐化酶檢測試劑盒WST-1檢測重組蛋白AdMn-SOD的超氧化物抑制百分率,測定其酶活性的單位

6、,并分析溫度、pH值對活性的影響。
　　 [結果]
　　 1.AdMn-SOD的生物信息學分析
　　 推導AdMn-SOD cDNA完整ORF為648bp,編碼216個氨基酸殘基組成的多肽。AdMn-SOD包含有保守的與錳離子結合的3個組氨酸殘基及1個天冬氨酸殘基(His-46,His-94,Asp-178,His-182),具有Mn-SOD具有的"DVWEHAYY"保守結構。AdMn-SOD前端20個氨基酸殘基

7、組成信號肽序列,第21～216個氨基酸序列為其蛋白序列;經用TargetP預測,AdMn-SOD位于線粒體中。
　　 用BLAST N及BLAST P程序在GenBank中檢索相似性序列,結果顯示AdMn-SOD基因序列及其推導的編碼蛋白與秀麗小桿線蟲、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergri)及中國對蝦(Fenneropenaeus chinenMs)等線粒體Mn-SOD具有較高相似性。與其它線蟲及部分代表

8、性物種的Mn-SOD氨基酸序列比較及進化樹研究表明,AdMn-SOD具有Mn-SOD的保守結構,且與線蟲Mn-SOD親緣關系較近。
　　 2.AdMn-SOD的原核表達
　　 運用RT-PCR技術擴增獲得了AdMn-SOD的成熟蛋白編碼序列,并成功構建了pET32a/AdMn-SOD原核表達重組質粒。構建好的重組表達質粒pET-32a/AdMn-SOD轉化至大腸桿菌BL21(DE3)后,IPTG能誘導目的蛋白AdMn-S

9、OD在大腸桿菌BL21(DE3)中高效地可溶性表達。優(yōu)化條件下可獲純化的重組AdMn-SOD可溶性目的融合蛋白量達44.4mg/ml。
　　 3.重組AdMn-SOD的活性檢測
　　 純化的重組AdMn-SOD活性(抑制率％)為95.5,酶活性單位為3169u/mg。pH值在6.5和9.5之間對其活性影響不大,其最適pH為8.5;隨溫度的升高,其活性逐漸降低,在90℃仍存在40%以上活性,因此可知重組AdMn-SOD對溫