十二指腸鉤蟲蛋白酶抑制劑Ad-KPI-2、Ad-API-1的克隆及其表達研究.pdf

1、[目的]
　　 在實驗室前期分離獲得十二指腸鉤蟲 Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑Ad-KPI-2(Genebank登錄號:EF495070)及天冬氨酸蛋白酶抑制劑Ad-API-1(Genebank登錄號:EF490131)的基礎上,本論文對推導的Ad-KPI-2及Ad-API-1的氨基酸序列進一步進行生物信息學分析;構建Ad-KPI-2及.Ad-API-1成熟肽原核表達系統(tǒng),在大腸桿菌(E.coli)中融合表達Ad-KPI-2

2、及Ad-API-1,并分離純化的重組Ad-KPI-2及Ad-API-1;檢測重組Ad-KPI-2的的活性并初步分析其作用機制。研究結果將為進一步研究Ad-KPI-2及Ad-API-1的生物學功能并探討它們在致病中的作用奠定基礎。
　　 [方法]
　　 1.Ad-KPI-2和Ad-API-1的生物信息學分析
　　 運用生物信息學軟件分別對 Ad-KPI-2和 Ad-API-1的編碼序列進行分析,預測編碼蛋白的結構及

3、理化性質。
　　 2.Ad-KPbI-2、Ad-API-1的原核表達載體的構建、表達及純化
　　 分別從克隆質粒中及cDNA中擴增的Ad-KPI-2、Ad-API-1編碼成熟肽編碼序列,相應編碼序列經雙酶切后分別連接到表達載體pET-32a中,經鑒定正確的表達重組質粒pET-32a/Ad-KPI-2、pET-32a/Ad-API-1分別轉化至大腸桿菌BL21(DE3)后,用IPTG誘導表達,表達情況用SDS-PAGE進行

4、分析,大量誘導表達重組融合蛋白 Ad-KPI-2、Ad-API-1用Ni親和層析柱進行純化備用。
　　 3.Ad-KPI-2的活性測定
　　 運用發(fā)色底物法檢測重組融合蛋白Ad-KPI-2對α-胰糜蛋白酶、胰彈性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的抑制活性情況。
　　 [結果]
　　 1.生物信息學分析表明:Ad-KPI-2由84個氨基酸殘基組成,其成熟肽由68個氨基酸殘基組成,分子量為7923.9 Da,等電點

5、為6.15,含有典型的Kunitz型結構域,是一種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑。Ad-API-1由228個氨基酸殘基組成,其成熟肽由213個氨基酸殘基組成,分子量為23754.8 Da,等電點為5.79,含有P13結構域,是一個典型的天冬氨酸蛋白酶抑制劑。
　　 2.成功構建了原核表達質粒pET-32a/Ad-KPI-2和pET-32a/Ad-API-1,用IPTG誘導獲得了重組Ad-KPI-2和Ad-API-1,并用鎳親和

6、層析獲得了純化的重組蛋白。
　　 3.初步實驗表明重組融合蛋白Trx-Ad-KPI-2對α-胰糜蛋白酶和彈性蛋白酶具有顯著的抑制作用,但對胰蛋白酶和胃蛋白酶無抑制作用。
　　 [結論]
　　 經生物信息學分析表明Ad-KPI-2是一種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑,Ad-API-1是一種天冬氨酸蛋白酶抑制劑。本文成功構建了原核表達質粒pET32a/Ad-KPI-2和pET32a/Ad-API-1,并在大腸桿菌中