應(yīng)力條件下成肌細胞增殖、分化和凋亡的調(diào)控及其分子機制的探討.pdf

1、口腔頜面部的畸形嚴重影響患者的身心健康和家庭幸福,功能矯治成為重要的治療手段。面頜部肌肉組織的適應(yīng)性變化在牙頜面畸形的矯治中扮演著重要角色。探討矯形力對肌肉細胞的增殖、分化、凋亡的具體影響和分子機制,對進一步認識矯形治療的分子機制以及合理利用矯形力提高臨床預(yù)后具有重要意義。既往研究表明,應(yīng)力條件下ROS生成顯著增加,而JNK、NFkappaB也具有不同程度的活化,提示它們之間可能存在一定的聯(lián)系。而它們之間如何交互對話以及如何影響細胞的命

2、運尚不清楚。本研究旨在闡明機械牽張力條件下,ROS是調(diào)節(jié)JNK和NFkappaB這兩條信號通路間的交互作用的分子機制及其對細胞功能的具體影響。
　　【目的】本研究旨在探索不同應(yīng)力條件下ROS的動態(tài)變化,他們?nèi)绾斡绊懗杉〖毎脑鲋?、分化和凋?NFkappaB和JNK在該過程中的作用;從而獲得應(yīng)力調(diào)控細胞凋亡的相關(guān)信息,為正畸治療中合理使用應(yīng)力引起肌肉改建提供相應(yīng)的理論依據(jù)。
　　【方法與結(jié)果】(1)不同幅度的周期性應(yīng)力對成肌

3、細胞增殖、分化、凋亡的影響不同。本課題首先通過MTT和DNA Ladder實驗測定在受到不同大小的牽張應(yīng)力作用下(0％,5％,10％,15％,20％/10 cycles/ min)的C2C12細胞的增殖和凋亡的改變,通過檢測細胞分化相關(guān)基因的表達改變,分析應(yīng)力條件下細胞分化狀態(tài)的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn),5％的周期性應(yīng)力可以促進細胞的增殖,同時抑制分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)的細胞分化相關(guān)基因myogenin等的表達。當牽張應(yīng)力大于10％后,可以觀察到明顯的D

4、NA斷裂。除此以外,我們還發(fā)現(xiàn)牽張應(yīng)力大于10％后,細胞內(nèi)開始出現(xiàn)大量的PARP剪切產(chǎn)物,隨應(yīng)力的增加而增多。當周期性牽張應(yīng)力超過15％10cycles/min時,整體存活細胞數(shù)明顯降低。由此可見,高強度牽拉介導(dǎo)的細胞凋亡,參與整體細胞數(shù)的減少,可能不利于組織的重塑和再生。(2)周期性應(yīng)力對ROS的產(chǎn)生、NFkappaB活性、JNK1活化的影響。我們通過熒光染料檢測ROS的生成,熒光報告系統(tǒng)檢測NFkappaB的活性以及Western

5、Blot檢測磷酸化和總體JNK1的水平;分析不同應(yīng)力條件下細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量、JNK和NFkappaB的活化程度以及它們間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著周期性應(yīng)力的增加,細胞內(nèi)ROS生成逐漸增加。隨著應(yīng)力的增大,細胞的凋亡逐漸增加,與此同時,JNK1活性逐漸增高,而JNK1表達水平并沒有明顯改變。與ROS生成量和JNK1活化逐漸增加不同,應(yīng)力在10％以下時NFkappaB的活性隨著應(yīng)力的增大而增大,而當應(yīng)力大于15％時,NFkappaB活性開

6、始下降。為了闡明ROS和JNK活性二者之間的關(guān)系,我們提前4小時對細胞使用不同濃度的ROS清除劑NAC,然后對細胞施加20％/10cycles/min的牽張應(yīng)力24小時。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ROS的產(chǎn)生被NAC抑制。當NAC的濃度達到100μM時,ROS降至基線水平。10μM NAC開始抑制JNK的活性,隨著NAC的濃度的增加,JNK活性逐漸降低。10μM NAC處理后增加NFkappaB的活性。NAC濃度的繼續(xù)增加,NFkappaB的活性先升高

7、后降低,當NAC升高至1000μM時,NFkappaB的活性降至基線以下水平。所有這些結(jié)果提示,當ROS的量積累到一定的時候,JNK開始激活,而ROS的量較低的時候,NFkappaB被激活。(3)低強度應(yīng)力條件下NFkappaB的活化,促進miR146a的表達,后者抑制細胞分化。鑒于低強度條件下,NFkappaB活化,細胞增殖增加而分化受阻。我們分析了該條件下,NFkappaB的重要下游靶分子miR146a的表達及其在過程中的作用。采用

8、miRNA特異性qRT-PCR我們發(fā)現(xiàn),低強度應(yīng)力條件下,miR146a表達增加,過表達miR146a可以抑制細胞的分化,抑制miR146a的功能可以促進細胞的分化。借助生物信息學發(fā)現(xiàn),分化重要的調(diào)節(jié)基因Numb是miR146a的靶分子,而過表達miR146a可以觀察到Numb的表達降低。Numb的3’UTR報告系統(tǒng),顯示miR146a可以抑制Numb的3’UTR的活性。(4)高強度應(yīng)力條件下,ROS大量產(chǎn)生,JNK1的激活抑制NFka

9、ppaB的活化。在較強的應(yīng)力作用下,NFkappaB和JNK的活性變化呈現(xiàn)相反的關(guān)系,提示JNK的活性可能引起了NFkappaB活性的降低。因此,我們使用JNK的抑制劑預(yù)先處理細胞或者JNK的特異性RNAi24小時后施加20％的周期性的牽張力24小時。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,抑制JNK信號會增加NFkappaB的活性,進而增強細胞的存活。為了明確NFkappaB活性的抑制是否對JNK激活引起的細胞凋亡起關(guān)鍵作用,我們在JNK被抑制的情況

10、下進一步利用NFkappaB的阻斷劑aspirin。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與單純使用JNK抑制劑組相比,聯(lián)合使用JNK和NFkappaB的抑制劑顯著降低高強度應(yīng)力條件下細胞活力,說明在高強度應(yīng)力條件下,JNK活化通過抑制NFkappaB引起細胞凋亡。(5)高強度應(yīng)力條件下,JNK的激活阻斷了NFkappaB的核轉(zhuǎn)位和Bcl2的轉(zhuǎn)錄。為研究JNK1抑制NFkappaB的活化的詳細機制和下游效應(yīng),我們進一步通過分離胞漿胞核,分析NFkappaB的核定位

11、及RT-PCR分析其下游促進細胞存活分子的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),20％牽張應(yīng)力條件下,細胞核內(nèi)幾乎檢測不到的p65定位。不僅如此,20％的牽張應(yīng)力條件下NFkappaB的下游抗凋亡靶基因Bcl2幾乎不表達;阻斷JNK的活性引起細胞核中的NFkappaB水平升高,Bcl2的表達也得以恢復(fù)。不僅如此,我們還觀察到,JNK抑制劑的功能強于JNK1 siRNA,提示該過程中JNK的其他亞型也可能參與其中。
　　【結(jié)論】低強度的應(yīng)力,促進細胞的增