IRE-1-JKD通路在應力介導的成肌細胞凋亡中的作用及機制.pdf

1、目的:功能矯形，是矯治處于生長發(fā)育期中的青少年和兒童錯合畸形的一種重要的手段。功能矯治器通過咬合重建引發(fā)一系列的神經(jīng)肌肉收縮力的變化，該力傳遞到口腔周圍的軟硬組織，促進軟硬組織的適應性變化，刺激頜骨和牙周組織的生長改建，改變頜骨的自然生長潛力，從而達到錯合畸形的目的。只有面頜部肌肉改建與口腔周圍軟硬組織相協(xié)調，功能矯形的效果才能穩(wěn)定，因此，探討面頜部肌肉適應性改建機制對于闡明功能矯形的原理具有指導意義。研究面頜部肌肉組織的適應性改建的機

2、制，須從細胞入手。成肌細胞是肌肉組織的干細胞，成肌細胞的增殖、分化和凋亡等生物學行為在面頜部肌肉的適應性改建中發(fā)揮著至關重要的作用，而成肌細胞的凋亡是當今研究的熱點。經(jīng)典的細胞凋亡的途徑有兩條:包括外源性的死亡活化受體途徑和內源性的線粒體損傷途徑，而內質網(wǎng)途徑是近年來逐漸被人們揭示的一條新的凋亡途徑。當細胞內外環(huán)境的改變引起內質網(wǎng)內未折疊或錯誤折疊蛋白質聚集，鈣穩(wěn)態(tài)失衡，從而導致的內質網(wǎng)功能紊亂的狀態(tài)，發(fā)生內質網(wǎng)應激。為了減輕內質網(wǎng)應激

3、，真核細胞激活一些列自身保護機制，稱為未折疊蛋白反應;但持續(xù)的或者過強的內質網(wǎng)應激，會導致細胞發(fā)生凋亡。本研究建立在成功構建成肌細胞體外培養(yǎng)力學刺激模型的基礎上，旨在探索周期性應力引起成肌細胞凋亡的規(guī)律，探討內質網(wǎng)應激IRE-1-JNK信號通路在該過程中的作用及其機制;從而獲得應力調控成肌細胞凋亡的信息，為功能矯形治療中合理使用應力以及闡明面頜部肌肉的適應性改建的機理提供的理論依據(jù)。
　　方法:體外培養(yǎng)L6大鼠成肌細胞，應用多通道

4、應力加載裝置對分別對成肌細胞加載0h、1h、2h、6h、12h和24h的周期性張應力(頻率為10 cycles/min，拉伸變形率為15％)，構建成肌細胞-體外培養(yǎng)力學刺激模型，對照組為不加力組(0h)，對照組與實驗組其他培養(yǎng)條件相同。應用Hochest33258染色觀察不同應力加載時間對成肌細胞凋亡的影響;應用AnnexinⅤ-FITC/PI流式細胞術檢測成肌細胞的凋亡率;采用Real Time PCR檢測內質網(wǎng)應激相關因子Chop、

5、TRAF2、ASK1和JNK mRNA的表達變化;應用Western blotting檢測JNK蛋白的表達變化;加入IRE-1特異性抑制劑STF-083010后檢測TRAF2、ASK1和JNK mRNA和JNK蛋白的表達變化，以明確IRE-1-JNK通路在應力介導成肌細胞凋亡中的作用及機制，采用SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析。
　　結果:
　　1、Hochest33258染色、AnnexinⅤ-FITC/PI流式細胞術檢

6、測成肌細胞凋亡率，結果一致表明周期性張應力（頻率為10 cycles/min，拉伸變形率為15％）可誘導體外培養(yǎng)的成肌細胞發(fā)生凋亡，并且凋亡率隨應力加載時間的延長而呈一致上升趨勢，且在24h達峰值。
　　2、Real Time PCR結果顯示:CHOP、TRAF2、ASKl mRNA表達量隨應力加載時間的延長而逐漸上升，并在24h達最高值，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); JNK mRNA的表達量在0～2h逐漸上升后逐漸下降，隨

7、后又逐漸上升在24h達最高值，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3、Western blotting結果顯示:JNK蛋白隨著應力加載時間的延長，先升高，其后略有下降，并于24h達到最高值，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4、加入大鼠IRE-1特異性抑制劑STF-083010后，Real Time PCR檢測TRAF2、ASK1JNK mRNA表達，結果顯示:TRAF2、ASK1表達量均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義

8、(P＜0.05)，與對照組（0h不加抑制劑組）表達量的差別無統(tǒng)計學差異;JNK表達量與不加抑制劑組明顯降低，但仍高于對照組與對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5、加入抑制劑后，Western blotting檢測JNK蛋白表達變化，結果顯示，隨應力加載時間的延長，JNK蛋白表達量與不加抑制劑組比較其表達量明顯降低，但仍高于對照組（0h不加抑制劑組），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但是加抑制劑后各組之間的差別無統(tǒng)計

9、學意義。
　　結論:
　　1、周期性張應力（頻率為10 cycles/min，拉伸變形率為15％）可誘導成肌細胞的凋亡，并且隨著應力加載時間的延長，凋亡率隨著應力加載時間的延長而升高。
　　2、CHOP、TRAF2、ASK1、JNK mRNA及JNK蛋白的表達量升高，提示內質網(wǎng)相關的凋亡途徑參與了應力介導的成肌細胞的凋亡。
　　3、加入IRE-1抑制劑后，TRAF2、ASK1、JNK mRNA及JNK蛋白表達量均