霍亂弧菌體內誘導及在海水中生物膜形成相關基因的篩選與鑒定.pdf

1、霍亂弧菌既是自然水生環(huán)境中的土著性細菌也是引起人類腹瀉疾病-霍亂的病原體。在自然環(huán)境中霍亂弧菌常常以生物膜的形式附著于生物體或者非生物體表面。生物膜是指附著于物質表面由細菌胞外多糖基質包裹的微生物群體，生物膜形態(tài)被認為是霍亂弧菌能在自然環(huán)境中長期存活的重要原因并與霍亂的季節(jié)性爆發(fā)有關。當霍亂孤菌進入人體以后，通過調控一系列體內特異性誘導表達基因來適應宿主體內環(huán)境實現(xiàn)成功感染。 基于抗生素抗性的體內表達技術是一種用于篩選病原菌同宿

2、主相互作用過程中體內特異性誘導表達基因的方法。本實驗利用一種基于kan-rpsL抗性標簽的體內表達技術篩選篩選了霍亂弧菌在感染成年小鼠過程中特異性誘導表達基因。首先通過轉座子隨機突變法建立了染色體上含無啟動子的kan-rpsL抗性標簽的突變子文庫，文庫細胞先通過體外高濃度鏈霉素篩選去除組成型表達菌株，然后經兩輪體內體外篩選驗證，獲得體內卡那霉素抗性體外鏈霉素抗性/卡那霉素敏感的突變株就是轉座子插入位點上游含體內誘導啟動子的突變株。利用這

3、種篩選策略共篩選到了5個含體內誘導基因的突變株，對突變株轉座子插入位點序列的分析確定了4個霍亂弧菌感染成年小鼠過程中特異性誘導表達基因。其中一個基因VC0303編碼一種紐氨酸激酶感受蛋白，這種蛋白分子通常與另外一種調節(jié)蛋白構成雙組分系統(tǒng)調節(jié)細菌許多重要的生理功能，另外確定的3個基因與氨基酸及核酸代謝相關，這類基因在以往的體內表達技術篩選中通常是占篩選到的體內表達基因中最多的一部分，表明這類代謝相關基因在霍亂弧菌感染過程中發(fā)揮重要作用。我

4、們的研究結果表明，為了在小鼠體內生存及增殖，霍亂弧菌必需調節(jié)與感受和代謝相關的基因。同時通過對編碼組氨酸激酶的VC0303基因的監(jiān)測表明，該基因在LB和霍亂毒素誘導培養(yǎng)基AKI中均不能被誘導表達。 為了鑒定霍亂弧菌在人造海水中生物膜形成相關基因，采用轉座子隨機突變法在聚苯乙烯96孔板中篩選了相關基因.總共獲得了10株生物膜增加突變株，對轉座子插入位點的序列分析確定了9個生物膜相關基因。其中rfbU基因編碼一種甘露酰轉移酶，該基因

5、和其下游基因rfbV是形成霍亂弧菌O抗原所必需的。對rfbU突變株的生物膜形成情況檢測發(fā)現(xiàn)，該突變株在海水中能夠形成比野生型菌株更厚的生物膜，同時對該突變株在LB和海水中細菌脂多糖(LPS)的檢測發(fā)現(xiàn)突變株都不能產生LPS，表明LPS抑制霍亂弧菌海水中生物膜的形成。另外通過突變以及染色體上組成型表達另一個突變株轉座子插入位點下游磷酸戊糖途徑(PPP)相關基因的研究發(fā)現(xiàn)，PPP途徑相關基因是霍亂弧菌海水中形成增厚生物膜所必需的。所有這些發(fā)