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文檔簡介
1、霍亂,又稱為亞細(xì)亞霍亂或傳染性霍亂,是主要由O1和O139血清型霍亂弧菌引起的一種烈性、猝發(fā)性的細(xì)菌性傳染病,其危害僅次于鼠疫。隨著環(huán)境和人類生活方式的轉(zhuǎn)變,霍亂弧菌已經(jīng)出現(xiàn)了細(xì)菌毒力、菌落特征等方面的變異。而隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,霍亂弧菌的檢測方法也從傳統(tǒng)的表型特征鑒定向遺傳特征基因鑒定轉(zhuǎn)變。為了能夠準(zhǔn)確、快速、安全的檢測霍亂弧菌,特別是產(chǎn)毒型霍亂弧菌,本研究首先從分子生物學(xué)水平構(gòu)建了包含霍亂弧菌全套基因的Fosmid文庫,使霍亂弧菌
2、遺傳信息轉(zhuǎn)移到易于培養(yǎng)的大腸桿菌中去;通過基因水平的篩選,獲得了霍亂弧菌常見的5種高度保守特征基因。為了滿足普通實(shí)驗(yàn)室對霍亂弧菌陽性對照的需求,本論文對篩選出的5種霍亂弧菌保守基因的Fosmid質(zhì)粒進(jìn)行穩(wěn)定性研究,制備出可作為陽性對照的霍亂弧菌Fosmid質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品并以制備的tcpA-Fosmid質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品為模板,通過對傳統(tǒng)切刻內(nèi)切恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(NEMA)的優(yōu)化和改良,建立一種新型的O1和O139型霍亂弧菌的切刻內(nèi)切恒溫?cái)U(kuò)增(NEM
3、A)快速檢測方法。
1.選取O1和O139型霍亂弧菌為研究對象,利用低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋法獲得高質(zhì)量的O1和O139型霍亂弧菌基因組DNA,用隨機(jī)剪切法將基因組進(jìn)行片段化處理,脈沖電泳分離片段化DNA并切膠回收33kb~48kb之間的DNA片段,然后對DNA片段進(jìn)行末端平滑化和磷酸化處理,與pCC1FOS載體連接,經(jīng)包裝、轉(zhuǎn)染、篩選陽性克隆構(gòu)建霍亂弧菌Fosmid文庫。所建的Fosmid文庫庫容量為355Mb,平均插入片段為35k
4、b,共保存9600個克隆,空載率小于2%。經(jīng)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證明所建文庫克隆能夠穩(wěn)定繁殖。為下一步O1和O139型霍亂弧菌目的基因的篩選、文庫的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
2.利用實(shí)時熒光PCR從霍亂弧菌Fosmid文庫中篩選出含tcpA、ctxAB、hlyA、rfb-O1和rfb-O139保守性特征基因的陽性克隆菌株,通過提取Fosmid質(zhì)粒并對其穩(wěn)定性進(jìn)行研究,最終研制出具有較好穩(wěn)定性的含有霍亂弧菌tcpA基因、hlyA基因、rfb-
5、O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因的Fosmid質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品。該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的研制基本滿足了實(shí)驗(yàn)室對霍亂弧菌陽性對照的需求。
3.選取已制備的tcpA-Fosmd質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品為陽性模板,對傳統(tǒng)NEMA技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化和改良。在參考傳統(tǒng)的NEMA反應(yīng)體系基礎(chǔ)上,對影響擴(kuò)增效率的關(guān)鍵因素—如溫度、緩沖環(huán)境、鎂離子及DMSO濃度分別進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)試驗(yàn)確定,以磷酸鉀緩沖液作為緩沖環(huán)境,反應(yīng)溫度59℃、鎂離子和DMSO終濃度分別
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