結核分枝桿菌生物膜形成相關基因的篩選與鑒定.pdf

1、目的：通過菌落表型變化并結合生物膜生長缺陷篩選并鑒定可能與結核分枝桿菌生物膜形成相關基因。
　　方法：利用帶有Himar1轉(zhuǎn)座子的MycoMarT7轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)建立結核分枝桿菌H37Ra隨機插入突變庫;篩選細菌表面結構發(fā)生變化和生物膜形成有變化的突變菌株;運用T-A克隆法并結合抗性標記挽救法獲得突變菌株的隨機插入基因側(cè)翼序列,使用通用引物M13F和M13R進行測序,將測序結果與結核分枝桿菌H37Ra全基因組序列進行比對,并分析判斷從

2、而鑒定轉(zhuǎn)座子插入位點。并運用生物信息學方法分析預測突變基因的功能,進而鑒定出與菌落形態(tài)或者生物膜形成相關基因。
　　結果：成功構建庫容量約為1×104結核分枝桿菌轉(zhuǎn)座子隨機插入突變文庫。通過菌落形態(tài)變化及生物膜缺陷表型篩選出39株突變株,成功鑒定出插入位點的突變菌株有16株,涉及16個基因發(fā)生突變,與野生株相比,其中8株成膜能力未發(fā)生任何變化,在20~25d即可形成生物膜,而編號P7C8的突變株為生物膜完全缺陷株,細菌培養(yǎng)觀察至7

3、周時間,依然未見生物膜形成表型;其余7株均出現(xiàn)生物膜生長或成熟延遲情況,其中2株成膜時間為30d時在氣液界面才出現(xiàn)薄膜樣,5株在40d左右才開始在氣液表面形成肉眼可見的薄膜層。運用生物信息學方法預測,16個發(fā)生突變的基因中5個與脂質(zhì)代謝相關,4個與細胞壁合成相關、2個與中間代謝和呼吸作用相關、1個調(diào)節(jié)蛋白相關基因,1個毒力相關基因,1個PE/PPE家族基因,還有2個功能未知基因。結合生物膜形成缺陷分析,其中8個基因可能與H37Ra體外生