小鼠IL-23基因在小鼠結(jié)腸癌細胞中的表達及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、本研究在已有工作的基礎(chǔ)上首先以結(jié)腸癌細胞株(Colon26)為基礎(chǔ)，構(gòu)建表達IL-23的結(jié)腸癌細胞株(Colon26/IL-23)，為深入研究IL-23的抗腫瘤作用，皮下接種小鼠觀察IL-23的抗腫瘤作用，并進一步探討IL-23抗腫瘤過程中細胞凋亡的變化及細胞凋亡抑制因子Survivin的表達情況。 研究方法：將攜帶mIL-23的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞株(PA317/IL-23)在完全培養(yǎng)基DMEM中，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2

2、4h，收集帶有mIL-23基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清液。以polybrene介導(dǎo)將攜帶mIL-23基兇的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染真核表達載體結(jié)腸癌細胞(Colon26)，經(jīng)G418(400mg/L)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性克隆細胞(Colon26/IL-23)。用DMEM培養(yǎng)這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陽性克隆細胞，待細胞呈對數(shù)生長時，用飽和酚-氯仿法提取陽性克隆細胞DNA，PCR鑒定目的基因是否整合到小鼠結(jié)腸癌細胞基因組中。用Trizol提取陽性克隆細胞RNA

3、，RT-PCR鑒定Colon26/IL-23目的基因mRNA的表達。用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液mIL-23分泌量。無菌取6周齡BALB/c小鼠脾臟，制成脾細胞懸液，加入Colon26/IL-23細胞培養(yǎng)上清液，培養(yǎng)48小時，收集上清液，用ELISA方法檢測IL-23刺激脾細胞產(chǎn)生IFN-γ的含量。用MTT比色法檢測Colon26/IL-23、Colon26和Colon26/LXSN的體外增殖反應(yīng)。將上述三種細胞分別接種8-10周

4、齡BALB/c小鼠，觀察其致瘤作用，并用游標(biāo)卡尺定期測量腫瘤大小，確定IL-23的抗腫瘤作用。8-10周齡BALB/c小鼠隨機分為四組，分別皮下接種Colon26/IL-23、Colon26和Colon26/LXSN，接種后10天、20天、30天皮下取瘤組織用流式細胞儀檢測瘤細胞凋亡率、用免疫組織化學(xué)的方法檢測瘤細胞中細胞凋亡抑制因子Survivin的表達情況。 研究結(jié)果：含mIL-23的PA317/IL-23細胞培養(yǎng)上清液與小

5、鼠結(jié)腸癌細胞共同培養(yǎng)獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性克隆細胞(Colon26/IL-23)，比較Colon26/IL-23、Colon26/LXSN與Colon26三種細胞的基兇組DNA，經(jīng)PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳，只在Colon26/IL-23細胞中擴增出長度約為581bp的mIL-23p19亞基基因的PCR產(chǎn)物。將三種細胞的總RNA經(jīng)RT-PCR擴增后，進行瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)只在Colon26/IL-23細胞的RNA中有1條與mIL-23p19

6、亞基基因大小相同的約581bp的帶。只在Colon26/IL-23細胞的培養(yǎng)上清中檢測到mIL-23的分泌，分泌量為(95±1.76pg/ml)。Colon26/IL-23細胞培養(yǎng)上清液刺激小鼠脾細胞IFN-γ分泌量顯著高于Colon26/LXSN和Colon26的分泌量(P＜0.01)。三種細胞體外增值無明顯差異(P＞0.05)、而在體內(nèi)致腫瘤作用不司，在Colon26/IL-23細胞接種后的早期腫瘤生長的速度及大小與Colon26/

7、LXSN和Colon26細胞接種組相似(P＞0.05)；在10d后，接種Colon26/IL-23細胞的小鼠腫瘤生長的速度變緩慢，接種后30d瘤體明顯減小，42d開始有小鼠腫瘤消退(P＜0.01)。流式細胞儀檢測，接種Colon26/IL-23細胞的小鼠腫瘤細胞凋亡率20天、30天有顯著差異(P＜0.01)。免疫組織化學(xué)染色，接種Colon26/IL-23細胞的小鼠腫瘤細胞Survivin的表達率與其它組相比20天、30天有顯著差異(P

8、＜0.01)。細胞凋亡率和Survivin的表達率作相關(guān)分析，二者呈顯著負相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=-0.6181。 研究結(jié)論：成功的構(gòu)建了Colon26/IL-23細胞，為深入研究IL-23抗腫瘤作用奠定了基礎(chǔ)。通過體外刺激IFN-γ分泌和體內(nèi)抑制腫瘤生長的研究，充分證明IL-23具有抗腫瘤作用。進一步研究IL-23抗腫瘤對細胞凋亡的影響發(fā)現(xiàn)，隨著IL-23治療作用的延長，Survivin的表達率逐漸減少，細胞凋亡率逐漸增加，總之