炎癥因子IL-23對小鼠骨髓來源巨噬細胞極化作用影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　巨噬細胞是機體固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分，但其組織分布、分化程度以及外界激活因子的多樣性賦予了巨噬細胞復雜的異質性與功能的多樣性。在組織微環(huán)境中，巨噬細胞的激活會受到多種因素的影響。病原體的入侵、體內壞死的細胞及碎片、其它細胞分泌的因子等刺激，均可使巨噬細胞的吞噬能力、細胞因子及趨化因子分泌能力、抗腫瘤能力、對趨化因子做出應答以及對抗原的加工遞呈能力等發(fā)生明顯變化。本實驗著重研究巨噬細胞對炎癥因子刺激發(fā)生的表型變化，明

2、確IL-23對經體外誘導建立的M2型骨髓來源巨噬細胞極化作用的影響。探討在IL-23作用下，表型發(fā)生變化后的M2型巨噬細胞對黑色素瘤細胞體外增殖和侵襲的影響，為以巨噬細胞再極化為靶點的腫瘤免疫治療提供實驗依據與新思路。
　　方法:
　　體外分離培養(yǎng)C57BL小鼠骨髓來源巨噬細胞，分別加入誘導因子IL-4、M-CSF和B16F10非接觸共培養(yǎng)建立三種M2型巨噬細胞模型，在此基礎上，觀察施加炎癥因子IL-23干擾后，三種M2型巨

3、噬細胞形態(tài)、分泌因子、細胞代謝和細胞表面標志物表達水平的變化:倒置顯微鏡下觀察在不同細胞因子刺激下，巨噬細胞形態(tài)變化;ELISA技術檢測三種M2型巨噬細胞分泌細胞因子表達情況，以及IL-23處理后分泌細胞因子表達水平的異同;Western blot技術檢測三種M2型巨噬細胞精氨酸代謝相關酶類表達量，以及IL-23處理后表水平的變化;流式細胞術檢測三種M2型巨噬細胞相關特異性細胞表面標志物表達量，以及IL-23處理后表達水平的變化。MTT

4、增殖實驗和Transwell實驗檢測IL-23處理后的M2型巨噬細胞上清對黑色素瘤B16F10細胞增殖能力和侵襲能力的影響。MTT增殖實驗和Transwell實驗檢測IL-23對黑色素瘤B16F10細胞增殖能力和侵襲能力的影響。
　　結果:
　　第一部分:IL-23對M2型巨噬細胞表型的影響。
　　三種M2型巨噬細胞模型經一定濃度IL-23處理后，細胞形態(tài)由纖維梭形向煎蛋樣形態(tài)（M1型形態(tài)）轉變;Elisa檢測IL-2

5、3處理后三種M2型巨噬細胞分泌因子變化，由IL-10highIL-12lowTNF-α low轉變?yōu)镮L-10low IL-12highTNF-α high;Western Blot顯示IL-23下調M2型巨噬細胞精氨酸酶（Arginase，Arg-1）的表達，同時上調誘導性一氧化氮合酶(Inducible nitric-oxide synthase，iNOS)的表達(P＜0.01)，精氨酸代謝向M1型方向轉化;流式細胞術分析顯示IL-

6、23下調M2巨噬細胞特異表面標志物CD206(P＜0.01)，并上調CD16/32(P＜0.05)和MHC-Ⅱ(P＜0.01)的表達。綜上，經IL-23處理后，三種M2型巨噬細胞的細胞形態(tài)、分泌因子種類、細胞代謝和細胞表面標志物表達水平均表明細胞已向M1型轉化，其是否對腫瘤細胞具有殺傷作用有待下一步研究。
　　第二部分: IL-23處理后M2型巨噬細胞對小鼠黑色素瘤細胞B16F10體外增殖、侵襲能力的影響。
　　根據第一部分

7、實驗結果，收集對照組M2型巨噬細胞和實驗組（IL-23處理組）巨噬細胞上清，并設置單純血清為空白組檢測其對黑色素瘤細胞B16F10增殖的影響。改良Transwell實驗檢測其對黑色素瘤細胞B16F10侵襲能力的影響。實驗結果表明:MTT細胞增殖實驗顯示與單純血清組相比，M2型巨噬細胞可促進腫瘤細胞的增殖，IL-23處理過后的M2型巨噬細胞上清抑制B16細胞增殖(P＜0.05)，這一效應與TNF-α的分泌相關;改良Transwell侵襲實

8、驗顯示IL-23處理過后的M2型巨噬細胞與對照組相比，穿入下室細胞數(shù)顯著減少(P＜0.01)。提示IL-23在改變巨噬細胞表型的同時，也恢復了M1型巨噬細胞的抗腫瘤免疫特性。
　　第三部分:IL-23對小鼠黑色素瘤細胞B16F10體外增殖、侵襲的影響
　　多數(shù)細胞因子以自分泌形式發(fā)揮效應，即主要作用于產生細胞本身和（或）臨近細胞，在局部發(fā)揮效應。其生物功能除參與免疫調節(jié)外，可直接作用于腫瘤細胞自身，調節(jié)腫瘤細胞的增殖與侵襲。

9、本部分選擇炎癥因子IL-23和黑色素瘤B16F10細胞進行體外實驗研究，通過培養(yǎng)腫瘤細胞，施加IL-23影響，觀察其對B16F10細胞增殖、侵襲能力的直接作用。實驗結果表明:與對照組相比，IL-23處理組B16F10細胞穿膜數(shù)明顯增多（P＜0.01）;腫瘤細胞MMP-2和MMP-9的表達活性增強(P＜0.01);B16細胞的增殖能力未見明顯變化。
　　結論：
　　本研究通過體外建立三種M2型巨噬細胞模型，應用Elisa、We

10、stern Blot、以及流式細胞術等技術，觀察炎癥因子IL-23對其表型變化的影響，并通過體外實驗觀察轉變后巨噬細胞對腫瘤細胞的影響，主要結論如下:
　　1、IL-23可促進M2巨噬細胞向M1型轉化，本實驗中的具體表型為TNF-α highIL-12high IL-10low，iNOS高表達，CD16/32和MHC-Ⅱ表達陽性細胞比例升高。
　　2、IL-23處理過后的M2型巨噬細胞可分泌具有細胞毒性的介質（TNF-α、N