GCS基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其與多藥耐藥的關(guān)系.pdf

1、背景與目的
　　 結(jié)腸癌是我國發(fā)病率很高的惡性腫瘤,其重要的治療手段化療,由于多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)現(xiàn)象,常導(dǎo)致化療效果的降低,嚴(yán)重影響了結(jié)腸癌患者的生存期和生存質(zhì)量。因此多藥耐藥現(xiàn)象成為臨床迫切需要解決的問題,以往對(duì)結(jié)腸癌多藥耐藥的研究多集中在多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrugrelated protein,MRP)及P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)等方面。近年來發(fā)現(xiàn)

2、神經(jīng)酰胺糖基化水平的提高可能是腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的一個(gè)新機(jī)制,而葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶(glucosylcemmide synthase,GCS)是神經(jīng)酰胺糖基化的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)GCS可以使神經(jīng)酰胺糖基化為無細(xì)胞毒性的葡萄糖神經(jīng)酰胺(glucosylceramide,GlcCer),減少細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥發(fā)生。
　　 本研究首先用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測了GCS在兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-8和HCT-8/VCR中

3、的表達(dá)情況,然后將靶向GCS的UGCG shRNA Plasmid轉(zhuǎn)染入人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR,檢測轉(zhuǎn)染后GCS的表達(dá)水平和對(duì)多藥耐藥的影響,。本課題從基因、蛋白等方面研究GCS與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展以及多藥耐藥產(chǎn)生的關(guān)系,并運(yùn)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)GCS的表達(dá)觀察能否逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌多藥耐藥,為臨床提高結(jié)腸癌化療敏感性多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)和提供一定的理論方向。
　　 方法：
　　 1常規(guī)培養(yǎng)HCT-8/VCR和HCT-8兩種

4、細(xì)胞,其中HCT-8/VCR細(xì)胞培養(yǎng)液中加入長春新堿(vincristine,VCR)2ug/ml,以維持其相應(yīng)的耐藥表型。開始測定前撤藥,進(jìn)行無藥培養(yǎng)2周。
　　 2用RT-PCR在mRNA水平、用細(xì)胞免疫化學(xué)法在蛋白水平測定GCS在HCT-8和HCT-8/VCR兩種細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 3用細(xì)胞活性(Cell Counting kit-8,CCK-8)法,測定HCT-8和HCT-8/VCR對(duì)VCR、5-氟尿嘧啶(5-

5、FU)和順鉑(DDP)的耐藥情況。
　　 4 UGCG shRNA Plasmid轉(zhuǎn)染HCT-8/VCR細(xì)胞。
　　 5 RT-PCR在mRNA水平、western blot在蛋白水平上檢測HCT-8/VCR轉(zhuǎn)染UGCG shRNA Plasmid后GCS表達(dá)的情況。
　　 6 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染UGCG shRNA Plasmid后HCT-8/VCR細(xì)胞對(duì)VCR、5-FU和DDP的敏感性。
　　 結(jié)果

6、：
　　 1 RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明:GCS在HCT-8和HCT-8/VCR細(xì)胞中均有表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示,GCSmRNA的相對(duì)表達(dá)量HCT-8為0.25±0.02,HCT-8/VCR為0.98±0.01,耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR表達(dá)水平較高,顯著高于親本細(xì)胞HCT-8(p<0.05)；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,GCS蛋白的相對(duì)表達(dá)量HCT-8為91.51±1.20,HCT-8/VCR為118.44±1.56,耐

7、藥細(xì)胞HCT-8/VCR表達(dá)水平較高,顯著高于親本細(xì)胞HCT-8(p<0.05)。
　　 2 CCK8分析結(jié)果顯示:HCT-8/VCR細(xì)胞對(duì)VCR、5-FU和DDP的IC50均高于HCT-8細(xì)胞(p<0.05)。表明HCT-8/VCR對(duì)VCR、5-FU、DDP等多種化療藥物耐藥,具有多藥耐藥性。
　　 3 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染UGCG shRNA Plasmid后的HCT-8/VCR的GCS

8、mRNA和蛋白的相對(duì)含量明顯低于HCT-8(p<0.05)；表明靶向GCS的UGCG shRNA Plasmid成功了的降低了GCS的表達(dá)。
　　 4 CCK8檢測轉(zhuǎn)染UGCG shRNA Plasmid后的HCT-8/VCR細(xì)胞結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染前比較,轉(zhuǎn)染后HCT-S/VCR細(xì)胞對(duì)ADR、VCR、5-FU和DDP的IC50減小,敏感性增高。
　　 結(jié)論：
　　 1結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8和HCT-8/VCR中均存在