α晶體蛋白促進視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突再生的機制研究.pdf

1、α晶體蛋白是晶狀體來源的“神經(jīng)保護物質(zhì)”之一，它能有效地促進損傷后的視神經(jīng)再生，但其作用機制不明。視神經(jīng)損傷后RGCs的繼發(fā)性死亡，是視神經(jīng)難以再生的原因之一，但是，單純保護RGCs存活并不能引起視神經(jīng)的有效再生，因為損傷局部環(huán)境中的抑制性物質(zhì)是阻礙視神經(jīng)再生的另一關鍵因素。這些抑制性物質(zhì)主要有髓鞘源性抑制物，膠質(zhì)瘢痕來源的抑制物，以及生長錐導向抑制物。目前研究已證明：RhoA/Rock的表達與活性變化對中樞神經(jīng)元軸突再生有著直接影響，

2、是眾多軸突再生抑制物信號傳導的共同作用點。而α晶體蛋白不僅能促進RGCs存活，而且對RGCs軸突再生也具有明顯促進作用。那么，阻礙軸突再生抑制物信號傳導的關節(jié)點----RhoA/Rock信號通路的傳導，是否是α晶體蛋白促進視神經(jīng)再生的機制?目前尚不清楚。 目的：通過在髓鞘抑制物質(zhì)包被的培養(yǎng)板上培養(yǎng)RGCs，研究α晶體蛋白是否能拮抗髓鞘抑制物的作用而促進RGCs突起生長。而后分別通過在體視神經(jīng)不全損傷大鼠模型和離體RGCs培養(yǎng)，研

3、究α晶體蛋白對RhoA、Rock的表達和活化情況，其下游物質(zhì)磷酸化情況，RGCs軸突再生及生長錐萎縮情況的影響。從而探討RhoA/Rock信號通路在α晶體蛋白促進視神經(jīng)再生中的作用。為視神經(jīng)損傷和再生的基礎研究提供理論依據(jù)，為臨床治療視神經(jīng)損傷探索可行方法。 方法：1、從大鼠晶狀體中提取混合晶體蛋白，用分子排阻凝膠色譜法純化分離α晶體蛋白，肽指紋質(zhì)譜法鑒定其純度；從大鼠腦組織中提取髓鞘抑制物質(zhì)，并對其成份及抑制神經(jīng)元軸突生長的功

4、能進行鑒定。2、在體實驗：以成年Long Evans大鼠為研究對象，分為視神經(jīng)損傷后玻璃體腔注射α晶體蛋白組、RhoA/Rock抑制劑組(陽性對照組)，和牛血清白蛋白組(陰性對照組)。通過western blot分析統(tǒng)計視網(wǎng)膜中RhoA/Rock表達變化，親和沉淀法研究RhoA活性變化，并進行統(tǒng)計學分析。同時視神經(jīng)順行示蹤檢測各組視神經(jīng)再生長度。3、離體實驗：在髓鞘抑制物包被的培養(yǎng)板上進行RGCs離體培養(yǎng)，分析比較培養(yǎng)1、3、5d，α晶

5、體蛋白組與陽性和陰性對照組有突起的細胞數(shù)、最長突起長度及cofilin和MLC磷酸化程度的統(tǒng)計學差異。同時觀察各組生長錐的萎縮情況。 結(jié)果：1、從大鼠晶狀體中提取并純化的α晶體蛋白經(jīng)肽質(zhì)紋質(zhì)譜分析為alphaA-crystalline和alphaB-crystalline的混合物。western blot檢測提取的髓鞘抑制物中含有髓鞘抑制物NogoA和MAG；在RGCs培養(yǎng)液中加入髓鞘抑制物1小時后，細胞生長狀態(tài)差，出現(xiàn)細胞碎片

6、，生長錐的膨大明顯縮小，板足回退；2h后生長錐萎縮消失，RGCs突起斷裂。在髓鞘抑制物質(zhì)包被的培養(yǎng)板上培養(yǎng)RGCs，培養(yǎng)1d、2d、3d、5d，α晶體蛋白組有突起的細胞數(shù)均較牛血清白蛋白組增多，突起長度也明顯長于牛血清白蛋白組(P<0.01)。 2、正常成年大鼠視網(wǎng)膜中，僅RGCs層可見少量RhoA和Rock表達；視神經(jīng)損傷后1天，RhoA和Rock主要分布于RGCs層；損傷3天達內(nèi)叢狀層；損傷7天后，分布于RGCs、內(nèi)叢狀層、

7、內(nèi)核層及外叢狀層。 3、視神經(jīng)損傷后1、3、7天，RhoA和Rock的表達均高于正常組(P<0.01～0.05)，并且活化的RhoA均較正常組明顯增多(P<0.01)。 4、視神經(jīng)損傷后，α晶體蛋白組、fasudil組及C3轉(zhuǎn)移酶組，活化的RhoA均較牛血清白蛋白組明顯減少(P<0.01～0.05)。但各組RhoA和Rock在視網(wǎng)膜中的表達量均無顯著統(tǒng)計學差異。 5、視神經(jīng)損傷后2周，牛血清白蛋白組僅可見極少量的

8、神經(jīng)纖維長入損傷區(qū)。而α晶體蛋白組及fasudil組，不僅損傷區(qū)可見較多的神經(jīng)纖維長入，而且，神經(jīng)纖維越過損傷區(qū)長入損傷區(qū)的遠端。 6、在蛋白上樣量基本一致的情況下，α晶體蛋白組和fasudil組磷酸化-cofilin和磷酸化-MLC占總cofilin和總MLC的比率，均明顯少于牛血清白蛋白組(P<0.01)，α晶體蛋白組和fasudil組比較無顯著統(tǒng)計學差異。 7、在髓鞘抑制物質(zhì)包被的培養(yǎng)板上培養(yǎng)RGCs，培養(yǎng)1、3、

9、5d，α晶體蛋白組和fasudil組有突起的RGCs數(shù)目均明顯多于牛血清白蛋白組(P<0.01)，細胞最長突起長度也顯著增長(P<0.01)。與α晶體蛋白組比較，培養(yǎng)1d時，有突起的細胞數(shù)fasudil組明顯增多(P<0.01)；培養(yǎng)3d和5d時，兩組無顯著統(tǒng)計學差異。但fasudil組細胞最長突起長度，于培養(yǎng)1、3、5d均較α晶體蛋白組明顯增長(P<0.01)。 8、未加髓鞘的正常生長錐末端可見明顯的膨大，并且可見較多的細小指

10、狀突起。加入髓鞘后，牛血清白蛋白組細胞突起末端膨大的生長錐消失，呈斷裂狀且未見細小分支；α晶體蛋白組和fasudil組細胞突起末端仍可見較小的膨大，并且可見少量的指狀突起。 結(jié)論：1、視神經(jīng)損傷可顯著增加RhoA、Rock在視網(wǎng)膜中的表達量，擴大其在視網(wǎng)膜中的分布范圍，并顯著增強RhoA活性。RhoA/Rock在視神經(jīng)損傷后再生過程中發(fā)揮重要的作用。 2、α晶體蛋白能拮抗髓鞘抑制物質(zhì)的抑制作用促進RGCs軸突再生。