Humanin抗低氧誘導的視網膜神經節(jié)細胞損傷作用的研究.pdf

1、目的：
　　 青光眼是一種不可逆的高致盲率眼病,嚴重影響患者的生活質量。近幾年來,隨著對青光眼診治水平的提高和青光眼視神經損害機制研究的深入,青光眼視神經的保護越來越受到人們的重視,在青光眼的治療中,只有在去除原發(fā)病因,降低眼壓的同時,注重視神經的保護性治療,阻止視網膜神經節(jié)細胞進一步損害,保護視功能,才能使青光眼的治療達到最佳效果。
　　 視網膜神經節(jié)細胞的凋亡是最終導致視神經損傷的重要因素,越來越多的研究表明:過高的

2、眼內壓,局部的缺血缺氧,免疫反應等危險因素可以誘發(fā)視網膜神經節(jié)細胞應激,啟動細胞內多種蛋白參與凋亡信號的級聯(lián)反應,造成神經元的凋亡與丟失,導致患者出現漸進性的視功能障礙。挽救和修復受損的視網膜神經節(jié)細胞;阻止視網膜神經節(jié)細胞的凋亡,使受損的細胞軸突再生并重新恢復功能是治療青光眼性視神經病變的重要途徑。視神經是中樞神經系統(tǒng)的一部分,目前,有越來越多的學者不再僅僅把青光眼當做一種單純的眼科疾病,而是認為青光眼是一種引起腦神經細胞退行性變性和

3、死亡的神經疾病,與阿爾茨海默病及帕金森病等具有相似之處。許多中樞神經保護劑如腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BD-NF)等都被證實同樣對RGCs具有保護作用。Humanin(HN)是一種由24個氨基酸殘基(MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA)組成的多肽,2001年首先由日本學者Hashimoto等在阿爾茨海默病患者的大腦枕葉內發(fā)現。由于阿爾茨海默病患者的枕葉在發(fā)病過程極少

4、受累,他們據此推測,大腦枕葉的神經元一定啟動了某種基因的表達,并由此形成了特殊的保護機制,使神經元免受阿爾茨海默病病變過程的毒性作用而死亡。最終他們通過從阿爾茨海默病患者枕葉提取的mRNA建立了包含開放讀碼框的cDNA文庫,發(fā)現了一種由75bp開放讀碼框架(ORF)編碼的24個氨基酸殘基組成的新型多肽,并將其命名為Humanin。研究發(fā)現,在離體培養(yǎng)的細胞中,HN能有效抑制多種FAD基因(APP、PS-1和PS-2)、Aβ完整肽鏈(Aβ

5、1-43或(Aβ1-42)及其衍生物((Aβ25-35或Aβ31-35)誘發(fā)的神經毒作用;而且在大鼠體內AD模型中也發(fā)現了Humanin的神經保護作用。因此Humanin被認為是AD特異或AD相關毒性(AD-relatedinsults)的神經保護肽。但后來的大量研究表明,Humanin可以在非AD相關的因素如興奮性神經毒,缺氧等誘導的神經及非神經細胞的損傷中都能起到細胞保護作用。除此之外,HN在腦組織以外的其他組織及不同的動物種屬如正

6、常大鼠的睪丸、結腸,MELAS型線粒體腦肌病患者的骨骼肌以及人類頸動脈粥樣硬化斑塊中都可見表達分布。另有研究報道稱FIN可拮抗線粒體功能障礙,抑制不同途徑的凋亡,還可以拮抗細胞內的鈣離子超載。HN的這些作用特點強烈提示,HN極有可能具有廣泛的細胞保護作用,是具有廣譜保護作用的內源性神經活性多肽,而不只是針對某種特定損傷(如AD相關毒性)而產生保護作用。
　　 FIN可能非常特異地阻止某些與細胞死亡有關的細胞通路,從而對控制細胞的

7、死亡起到非常重要的作用。為了進一步研究FIN是否對視網膜神經節(jié)細胞的死亡能起到阻斷作用,我們以化學低氧誘導劑氯化鈷(CoCl2)誘導視網膜神經節(jié)細胞-5(RGC-5)死亡,并以HN進行干預,從而檢測FIN對于低氧誘導的RGC-5損傷是否具有保護作用。另外,本試驗還就HN對低氧誘導視網膜神經節(jié)細胞損傷的保護作用與Bax,Bcl-2,和Caspase-3的表達、細胞凋亡的關系進行檢測,探討HN能否通過調節(jié)Bax,Bcl-2,和Caspase

8、-3的表達,抑制視網膜神經節(jié)細胞凋亡,發(fā)揮其神經保護作用。
　　 本實驗通過建立視網膜神經節(jié)細胞-5(RGC-5)的體外化學低氧誘導損傷模型,探討不同濃度Humanin(HN)對體外低氧誘導培養(yǎng)的視網膜神經節(jié)細胞損傷的影響作用;探討HN預處理對低氧誘導視網膜神經節(jié)細胞損傷的保護作用機制是否涉及對凋亡的抑制。
　　 方法：
　　 將處于對數生長期的視網膜神經節(jié)細胞-5細胞分為三組:空白對照組、低氧誘導組、HN預處理

9、組。在細胞成功培養(yǎng)后,HN預處理組加入HN預處理12h,再與低氧誘導組一同加入最終濃度為200μM的CoCl2,繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細胞用于指標檢測。采用MTT比色法檢測細胞存活率,Hoechst33342染色及AnnexinV/PI流式細胞儀檢測細胞凋亡,應用westernblot法測定細胞內Bcl-2/Bax比值及活化的Caspase-3表達的改變。
　　 結果：
　　 MTT比色法顯示20gMHN預處理組細胞活性明

10、顯高于低氧誘導組(P＜0.01);Hoechst33342染色及流式細胞學結果顯示HN預處理組較低氧誘導組細胞凋亡率明顯下降(P＜0.01);westernblot法顯示:20gMHN預處理組Bcl-2/Bax較低氧誘導組增加,活化Caspase-3蛋白表達較低氧誘導組減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 結論：
　　 低氧處理后可導致RGC-5的損傷,一定濃度的HN可增加低氧誘導損傷的RGC-5細胞的生存率