NT-3通過p75NTR信號通路促進維甲酸誘導的皮膚源性前體細胞向神經元樣細胞分化.pdf

1、本研究旨在探討聯合應用全反式維甲酸(RA)和NT—3誘導皮膚源性前體細胞(SKPs)向神經元樣細胞分化及其可能機制，并利用腺病毒(Adv)作載體轉染NT—3基因進入SKPs聯合RA誘導后移植入大鼠全橫斷脊髓內觀察其在體內的存活和分化情況。為臨床上移植細胞替代治療中樞系統(tǒng)神經損傷提供新的治療策略和實驗依據。本研究分為以下四部分： (一)皮膚源性前體細胞的體外分離培養(yǎng)、純化及其分化潛能檢測 目的：建立一套成熟而穩(wěn)定的大鼠SK

2、Ps的培養(yǎng)方法為本課題后面的研究提供穩(wěn)定的細胞來源，并對其干細胞特性作以鑒定。 方法：取新生大鼠背部皮膚剪碎，胰酶消化后機械吹打胰酶消化的皮膚組織分離細胞，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取第3代培養(yǎng)增殖形成的細胞球，做Nestin、Sox2和Fibronectin免疫組化染色；消化打散成單細胞分化14天后做MAP—2、GFAP、Tuj1和NeuN染色。 結果：SKPs當傳至第3代時形態(tài)較均一，基本純化；SKPs表達神經干細胞的標志

3、性蛋白Nestin和Sox2同時表達皮膚源性標志蛋白Fibronectin；SKPs自然分化條件下可以分化為MAP—2/Tuj1和MAP—2/NeuN陽性細胞以及GFAP陽性細胞，但神經元樣細胞分化率較低。 結論：成功培養(yǎng)的SKPs具有自我增殖和分化為神經元樣細胞和神經膠質樣細胞特性，但體外分化為神經元樣細胞較少。 (二)體外RA和NT—3聯合對SKPs誘導分化 目的：體外檢測RA和NT—3是否能誘導SKPs向神

4、經元樣細胞分化，以及各自的最佳誘導濃度和聯合誘導方法。 方法：用不同濃度的RA(10-8M～10-5M)誘導P3代SKPs7天，然后更換普通分化培養(yǎng)液繼續(xù)分化7天，同時設RA誘導14天對照組，免疫組化檢測SKPs分化為MAP—2和Tuj1陽性細胞率，確定最佳誘導濃度。然后以RA最佳誘導濃度誘導SKPs7天后再給與不同劑量(5ng/ml～40ng/ml)NT—3繼續(xù)分化7天，同時設NT—3單純作用14天分化組，免疫組化檢測SKPs

5、分化為MAP—2和Tuj1陽性細胞率，確定NT—3最佳誘導劑量。 結果：RA可以促進SKPs分化為更多的神經元樣細胞而且和誘導濃度相關，延長RA作用時間超過7天后并不能促進SKPs的神經元樣分化；10-6M對SKPs的誘導作用最佳。RA和NT—3聯合可以更好的促進SKPs的神經元樣分化，20ng/ml和NT—3聯合誘導作用最佳；NT—3單獨作用并不能促進SKPs的神經元樣分化。 結論：RA(10-6M)誘導SKPs7天后

6、再聯合應用NT—3(20ng/ml)7天可以誘導更多的SKPs向神經元樣細胞分化；延長RA作用時間和單獨應用NT—3都不能促進SKPs的神經元樣分化。 (三)RA聯合應用NT—3誘導SKPs向神經元樣細胞分化的可能機制 目的：探討RA聯合應用NT—3誘導SKPs向神經元樣細胞分化的可能機制。 方法：利用Western blot檢測RA誘導后NeuroD、p21、p75NTR和TrkC在SKPs中的表達變化，流式細

7、胞儀檢測RA誘導后SKPs的細胞周期變化，BrdU標記RA誘導后SKPs的分裂增殖變化，利用p75NTR的抑制劑(K252a)和TrkC的抑制劑(Pep5)結合誘導后SKPs神經元樣細胞分化率、凋亡和存活率探討RA和NT—3的可能作用機制。 結果：RA作用24h后就促進SKPs高表達NeuroD，而且隨時間延長逐漸降低；隨后RA促進SKPs表達p21并在第5天達到峰值隨后下降；RA促使大量SKPs停滯在G0/G1期，相應S期和G

8、2/M期細胞明顯減少；BrdU標記率在RA作用下比對照組明顯降低；RA可以促進SKPs細胞表達p75NTR上調，而對TrkC影響不大；p75NTR抑制劑Pep5可以降低RA聯合NT—3對SKPs的神經元樣分化的促進作用，而K252a(TrkC抑制劑)作用不明顯；RA誘導SKPs分化的同時促進了細胞凋亡，NT—3聯合RA作用可以降低細胞的凋亡率和促進分化細胞的存活，此種作用可以被Pep5所抑制，而K252a影響不明顯。 結論：RA

9、通過提高SKPs的NeuroD表達來促進更多細胞向神經元方向分化；RA隨后上調p21來抑制細胞的分裂增殖并促使細胞分化；RA同時上調p75NTR的表達并誘導細胞凋亡，NT—3可以和p75NTR結合抑制RA誘導的細胞凋亡促進分化細胞的存活。 (四)聯合應用NT—3基因重組腺病毒轉染和維甲酸預誘導的皮膚源性前體細胞在大鼠全橫斷脊髓內的存活和分化 目的：探討聯合應用NT—3基因重組腺病毒轉染和RA預誘導的SKPs移植入大鼠全橫

10、斷脊髓損傷后的存活和分化。 方法：首先在體外利用腺病毒轉染GFP基因進入SKPs決定最佳轉染MOI值，然后以最佳MOI值轉染NT—3基因進入SKPs，體外免疫組化檢測NT—3的分泌，收集AdvNT—3-SKP細胞的培養(yǎng)液作用于大鼠背根節(jié)神經細胞，檢測其分泌蛋白能否促進背根節(jié)神經細胞的軸突生長。體外RA作用于腺病毒轉染的SKPs檢測其神經元樣細胞分化率。RA誘導腺病毒轉染后的SKPs移植入全橫斷大鼠脊髓，存活64天后灌注固定，脊髓

11、組織切片作MAP—2、Tuj1和NeuN等免疫組化染色，激光共聚焦顯微鏡觀察移植細胞的存活和分化情況。 結果：腺病毒可以成功將目的基因轉染入SKPs，最佳MOI值為200；轉染NT—3后的SKPs可以表達NT—3陽性蛋白，而且其分泌液可以促進背根節(jié)神經細胞的軸突生長。RA作用于轉染NT—3基因的SKPs在體外可以促進其分化為更多的神經元樣細胞。移植的SKPs可以在大鼠全橫斷脊髓內存活至少64天，體外RA誘導可以促進體內移植細胞更