NT-3通過p75NTR信號通路促進(jìn)維甲酸誘導(dǎo)的皮膚源性前體細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化.pdf

1、本研究旨在探討聯(lián)合應(yīng)用全反式維甲酸(RA)和NT—3誘導(dǎo)皮膚源性前體細(xì)胞(SKPs)向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化及其可能機(jī)制，并利用腺病毒(Adv)作載體轉(zhuǎn)染NT—3基因進(jìn)入SKPs聯(lián)合RA誘導(dǎo)后移植入大鼠全橫斷脊髓內(nèi)觀察其在體內(nèi)的存活和分化情況。為臨床上移植細(xì)胞替代治療中樞系統(tǒng)神經(jīng)損傷提供新的治療策略和實驗依據(jù)。本研究分為以下四部分： (一)皮膚源性前體細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)、純化及其分化潛能檢測 目的：建立一套成熟而穩(wěn)定的大鼠SK

2、Ps的培養(yǎng)方法為本課題后面的研究提供穩(wěn)定的細(xì)胞來源，并對其干細(xì)胞特性作以鑒定。 方法：取新生大鼠背部皮膚剪碎，胰酶消化后機(jī)械吹打胰酶消化的皮膚組織分離細(xì)胞，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取第3代培養(yǎng)增殖形成的細(xì)胞球，做Nestin、Sox2和Fibronectin免疫組化染色；消化打散成單細(xì)胞分化14天后做MAP—2、GFAP、Tuj1和NeuN染色。 結(jié)果：SKPs當(dāng)傳至第3代時形態(tài)較均一，基本純化；SKPs表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志

3、性蛋白Nestin和Sox2同時表達(dá)皮膚源性標(biāo)志蛋白Fibronectin；SKPs自然分化條件下可以分化為MAP—2/Tuj1和MAP—2/NeuN陽性細(xì)胞以及GFAP陽性細(xì)胞，但神經(jīng)元樣細(xì)胞分化率較低。 結(jié)論：成功培養(yǎng)的SKPs具有自我增殖和分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞特性，但體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞較少。 (二)體外RA和NT—3聯(lián)合對SKPs誘導(dǎo)分化 目的：體外檢測RA和NT—3是否能誘導(dǎo)SKPs向神

4、經(jīng)元樣細(xì)胞分化，以及各自的最佳誘導(dǎo)濃度和聯(lián)合誘導(dǎo)方法。 方法：用不同濃度的RA(10-8M～10-5M)誘導(dǎo)P3代SKPs7天，然后更換普通分化培養(yǎng)液繼續(xù)分化7天，同時設(shè)RA誘導(dǎo)14天對照組，免疫組化檢測SKPs分化為MAP—2和Tuj1陽性細(xì)胞率，確定最佳誘導(dǎo)濃度。然后以RA最佳誘導(dǎo)濃度誘導(dǎo)SKPs7天后再給與不同劑量(5ng/ml～40ng/ml)NT—3繼續(xù)分化7天，同時設(shè)NT—3單純作用14天分化組，免疫組化檢測SKPs

5、分化為MAP—2和Tuj1陽性細(xì)胞率，確定NT—3最佳誘導(dǎo)劑量。 結(jié)果：RA可以促進(jìn)SKPs分化為更多的神經(jīng)元樣細(xì)胞而且和誘導(dǎo)濃度相關(guān)，延長RA作用時間超過7天后并不能促進(jìn)SKPs的神經(jīng)元樣分化；10-6M對SKPs的誘導(dǎo)作用最佳。RA和NT—3聯(lián)合可以更好的促進(jìn)SKPs的神經(jīng)元樣分化，20ng/ml和NT—3聯(lián)合誘導(dǎo)作用最佳；NT—3單獨作用并不能促進(jìn)SKPs的神經(jīng)元樣分化。 結(jié)論：RA(10-6M)誘導(dǎo)SKPs7天后

6、再聯(lián)合應(yīng)用NT—3(20ng/ml)7天可以誘導(dǎo)更多的SKPs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化；延長RA作用時間和單獨應(yīng)用NT—3都不能促進(jìn)SKPs的神經(jīng)元樣分化。 (三)RA聯(lián)合應(yīng)用NT—3誘導(dǎo)SKPs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的可能機(jī)制 目的：探討RA聯(lián)合應(yīng)用NT—3誘導(dǎo)SKPs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的可能機(jī)制。 方法：利用Western blot檢測RA誘導(dǎo)后NeuroD、p21、p75NTR和TrkC在SKPs中的表達(dá)變化，流式細(xì)

7、胞儀檢測RA誘導(dǎo)后SKPs的細(xì)胞周期變化，BrdU標(biāo)記RA誘導(dǎo)后SKPs的分裂增殖變化，利用p75NTR的抑制劑(K252a)和TrkC的抑制劑(Pep5)結(jié)合誘導(dǎo)后SKPs神經(jīng)元樣細(xì)胞分化率、凋亡和存活率探討RA和NT—3的可能作用機(jī)制。 結(jié)果：RA作用24h后就促進(jìn)SKPs高表達(dá)NeuroD，而且隨時間延長逐漸降低；隨后RA促進(jìn)SKPs表達(dá)p21并在第5天達(dá)到峰值隨后下降；RA促使大量SKPs停滯在G0/G1期，相應(yīng)S期和G

8、2/M期細(xì)胞明顯減少；BrdU標(biāo)記率在RA作用下比對照組明顯降低；RA可以促進(jìn)SKPs細(xì)胞表達(dá)p75NTR上調(diào)，而對TrkC影響不大；p75NTR抑制劑Pep5可以降低RA聯(lián)合NT—3對SKPs的神經(jīng)元樣分化的促進(jìn)作用，而K252a(TrkC抑制劑)作用不明顯；RA誘導(dǎo)SKPs分化的同時促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，NT—3聯(lián)合RA作用可以降低細(xì)胞的凋亡率和促進(jìn)分化細(xì)胞的存活，此種作用可以被Pep5所抑制，而K252a影響不明顯。 結(jié)論：RA

9、通過提高SKPs的NeuroD表達(dá)來促進(jìn)更多細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化；RA隨后上調(diào)p21來抑制細(xì)胞的分裂增殖并促使細(xì)胞分化；RA同時上調(diào)p75NTR的表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，NT—3可以和p75NTR結(jié)合抑制RA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡促進(jìn)分化細(xì)胞的存活。 (四)聯(lián)合應(yīng)用NT—3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染和維甲酸預(yù)誘導(dǎo)的皮膚源性前體細(xì)胞在大鼠全橫斷脊髓內(nèi)的存活和分化 目的：探討聯(lián)合應(yīng)用NT—3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染和RA預(yù)誘導(dǎo)的SKPs移植入大鼠全橫

10、斷脊髓損傷后的存活和分化。 方法：首先在體外利用腺病毒轉(zhuǎn)染GFP基因進(jìn)入SKPs決定最佳轉(zhuǎn)染MOI值，然后以最佳MOI值轉(zhuǎn)染NT—3基因進(jìn)入SKPs，體外免疫組化檢測NT—3的分泌，收集AdvNT—3-SKP細(xì)胞的培養(yǎng)液作用于大鼠背根節(jié)神經(jīng)細(xì)胞，檢測其分泌蛋白能否促進(jìn)背根節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的軸突生長。體外RA作用于腺病毒轉(zhuǎn)染的SKPs檢測其神經(jīng)元樣細(xì)胞分化率。RA誘導(dǎo)腺病毒轉(zhuǎn)染后的SKPs移植入全橫斷大鼠脊髓，存活64天后灌注固定，脊髓

11、組織切片作MAP—2、Tuj1和NeuN等免疫組化染色，激光共聚焦顯微鏡觀察移植細(xì)胞的存活和分化情況。 結(jié)果：腺病毒可以成功將目的基因轉(zhuǎn)染入SKPs，最佳MOI值為200；轉(zhuǎn)染NT—3后的SKPs可以表達(dá)NT—3陽性蛋白，而且其分泌液可以促進(jìn)背根節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的軸突生長。RA作用于轉(zhuǎn)染NT—3基因的SKPs在體外可以促進(jìn)其分化為更多的神經(jīng)元樣細(xì)胞。移植的SKPs可以在大鼠全橫斷脊髓內(nèi)存活至少64天，體外RA誘導(dǎo)可以促進(jìn)體內(nèi)移植細(xì)胞更