沉默p75NTR基因促進舌鱗癌細胞凋亡的分子機制研究.pdf

1、口腔頜面部最常見的惡性腫瘤是口腔鱗狀細胞癌(oralsquamouscellcarcinoma,OSCC)，大約占口腔惡性腫瘤的80％以上，舌部又是口腔鱗狀細胞癌最多發(fā)生的器官?？谇击[狀細胞癌和其他惡性腫瘤一樣其主要特點是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而腫瘤的無限增殖又是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。目前，以根治腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，尋找靶向腫瘤干細胞的抗癌策略，已成為許多腫瘤研究學(xué)者研究熱點。腫瘤干細胞(cancerstemcells，CSC)理論的提出，我們對腫瘤的

2、認識及治療進入了一個全新的領(lǐng)域，并推翻了以往對癌癥治療的基本原則。越來越多的有關(guān)基因治療腫瘤方面的研究成果充分說明，針對特殊基因來治療惡性腫瘤有十分好的應(yīng)用前景。RNA干擾技術(shù)即為此領(lǐng)域研究的突出成果之一，研究者針對特殊基因來治療惡性腫瘤以達到合成對應(yīng)siRNA片段的藥物，用于腫瘤的基因治療。
　　 p75NTR(p75NTRneurotrophinreceptr)低親和力神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(LNTFR)是分子量為75KDa的細胞

3、表面受體糖蛋白。p75NTR在多種系統(tǒng)腫瘤中的陽性表達已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和證實。其陽性表達量及p75NTR陽性細胞的侵襲特性與腫瘤預(yù)后有著密切的聯(lián)系，多數(shù)學(xué)者已將p75NTR列為評估腫瘤預(yù)后的診斷指標(biāo)。我們通過前期的研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR在口腔舌鱗狀細胞癌中都有陽性表達，并證實p75NTR陽性細胞具有干細胞增生分化的特性。因此有必要進一步研究p75NTR在舌鱗癌細胞增生或凋亡中的作用及其作用機制，特別是在分子水平研究p75NTR誘導(dǎo)舌鱗癌細胞增

4、生或凋亡的分子機制，發(fā)現(xiàn)p75NTR誘導(dǎo)舌癌細胞凋亡通路，描繪凋亡通路的一系列化學(xué)反應(yīng)，明確p75NTR在這一系列化學(xué)反應(yīng)鏈條中的位置及其上下游反應(yīng)的銜接因子，這將會為徹底根治舌癌，尋找靶向腫瘤干細胞的抗癌藥物具有重要的意義。
　　 目的：
　　 在生物學(xué)分子水平探求p75NTR介導(dǎo)口腔舌鱗癌細胞凋亡或增生可能的分子機制通路，為針對特殊基因來治療舌鱗癌，尋找靶向腫瘤干細胞的抗癌藥物提供可能的理論依據(jù)。
　　 方法

5、：
　　 1.舌鱗癌細胞的培養(yǎng)及p75NTR陽性細胞分選
　　 RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)舌癌細胞系Tca8113細胞。采用流式細胞分選技術(shù)于Tca8113鱗癌細胞中分選出p75NTR陽性細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)及活性情況。
　　 2.采用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)p75NTR蛋白在舌鱗癌細胞的表達
　　 根據(jù)人p75NTR基因（CD271GenBankA

6、ccessionNumber:NM-002507）的序列，共選擇2個位點設(shè)siRNA。將分選培養(yǎng)的p75NTR陽性細胞分為空白組、陰性組和實驗組進行siRNA轉(zhuǎn)染，48h后采用流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染效率;然后采用流式細胞儀AnnexinV/PI雙染色標(biāo)記法檢測各組舌鱗癌細胞凋亡的變化;最后應(yīng)用realtime-PCR檢測各組p75NTRmRNA的干擾效果，并用westernblot技術(shù)檢測p75NTR蛋白表達。
　　 3.weste

7、rnblot檢測轉(zhuǎn)染后各組舌鱗癌細胞BcL-2基因蛋白的表達變化。
　　 4.細胞免疫熒光標(biāo)記法觀察核內(nèi)因子NF-κB在細胞內(nèi)的分布特點。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功下調(diào)p75NTR蛋白表達以后實驗組的鱗癌細胞凋亡率比對照組的舌鱗癌細胞的凋亡率明顯增加，反向表明p75NTR有促進舌鱗癌細胞增殖的功能。
　　 2.通過細胞免疫熒光法觀察發(fā)現(xiàn)NF-κB在對照組細胞質(zhì)內(nèi)分布較少，細胞核內(nèi)較多，而實驗組細胞質(zhì)內(nèi)

8、NF-κB明顯多，細胞核內(nèi)NF-κB少。
　　 3.Westernblot方法檢測發(fā)現(xiàn)在實驗組舌鱗癌細胞凋亡增加時BcL-2表達增加。
　　 結(jié)論：
　　 1.p75NTR能促進舌鱗癌細胞增生分化或抗凋亡作用，p75NTR在舌鱗癌細胞中有著“正向”的生物效應(yīng)。
　　 2.p75NTR促進舌鱗癌細胞增生分化或抗凋亡的分子機制可能是通過激活NF-κB通路實現(xiàn)的。
　　 3.下調(diào)p75NTR引起舌鱗癌細