大鼠心肌細胞分離和基因表達的實驗研究.pdf

1、背景:心肌細胞轉錄水平是心臟病領域的重要研究方法,幫助認識疾病的發(fā)病機制。傳統(tǒng)研究所用的對象多是心肌組織,但是在正常的心室壁組織中,除心肌細胞外,還有成纖維細胞、平滑肌細胞以及其它類型細胞,這些細胞存在會對分析心肌細胞基因表達水平造成很大的干擾。所以我們更需要分離心肌細胞后再進行基因表達分析。既往許多研究者設計過不同的分離心肌細胞的方法,但均有各種的不足,如對于操作技術、設備要求較高、分離時間過長、細胞得出量較少等。酶解法是一種常用的分

2、離心肌方法,但技術操作細節(jié)的差異使其分離的結果不盡一致,且尚無對于分離后提取RNA進行基因表達分析的效果進行詳細的研究。本文將對該方法進行深入研究,并進行轉錄水平分析,為進一步使用純化的心肌細胞進行轉錄水平研究提供基礎和依據。
　　 方法:對8周雄性SD大鼠的心臟應用Langendorff灌流酶解法進行心肌細胞分離純化,分離得到的細胞進行普通光學顯微鏡觀察并細胞計數；吖啶橙染色后用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)；提取總RNA后應用分光光

3、度計、瓊脂糖凝膠電泳和測RNA完整指數(RNA integrity number,RIN)的方法檢測RNA完整性；用Real-time RT-PCR的方法檢測心肌組織中三種細胞特異性標志的相對表達量:肌鈣蛋白T(TnT,心肌細胞)、波形蛋白(Vim,成纖維細胞)和平滑肌α肌動蛋白(α-SMA平滑肌細胞),作為內參的看家基因分別為肽脯氨酰異構酶A(PPIA)和核糖體蛋白(RPLP0)。此外選用2周齡、3周齡和8周齡的雄性Wistar大鼠進

4、行心肌細胞分離,分離后提取RNA,用Real-time RT-PCR的方法檢測心肌組織中腺嘌呤核苷酸易位酶(ANT)的兩種亞型ANT-1和ANT-2的表達量,內參基因選擇PPIA。
　　 結果:整個心肌分離過程大約需要30分鐘左右,可以得到比較好的心肌產出率,普通光學顯微鏡下觀察絕大部分細胞形態(tài)完整呈桿狀,有明顯的橫紋,吖啶橙染色后在熒光顯微鏡下觀察亦可見細胞形態(tài)完整,細胞核被染成明亮的綠色,而細胞外的背景幾乎沒有熒光產生。將形

5、態(tài)典型的心肌細胞記為心肌細胞,其它均作為不典型細胞,3只大鼠的細胞計數結果n心肌細胞/n所有細胞分別為:87.3±3.2％,91.8±5.1％,88.1±3.3％。提取的總RNA的A260/280在1.8-2.0之間,符合Real-time RT-PCR需要的RNA純度；電泳結果提示RNA沒有明顯的降解,與心肌組織提取的RNA無明顯差異(n=3)；RIN值在7-8之間,亦適于進行Real-time RT-PCR,與心肌組織提取的RNA無

6、明顯差異(n=6,P>0.05)。通過Real-time RT-PCR檢測TnT、Vim和α-SMA相對于PPIA和RPLP0的表達量,均為經過分離Vim和α-SMA的表達量顯著下降,而TnT的表達量顯著上升(n=6,P<0.05),三者的變化倍數分別為0.38、0.16、2.56(PPIA作為內參)和0.35、0.17、2.33(RPLP0作為內參)。ANT-1在心肌細胞中的表達量要遠高于ANT-2(10±1.3倍,n=6),高的倍數

7、比之前文獻報道(以心肌組織作為樣本)的結果要更顯著,ANT-1和ANT-2在心肌發(fā)育過程中(2周、3周和12周)表達量的變化(n=6)也與之前文獻報道(以心肌組織作為樣本)有所差異。
　　 結論:
　　 1.通過對既往文獻的總結,完善了Langendorff灌流酶解分離大鼠心肌細胞的方法,提純度可達90％,細胞產量較高,適于提取RNA進行進一步研究；
　　 2.該方法在分離過程中RNA沒有明顯的降解,適用于心肌基