激活NF-κB信號通路的TGEV蛋白篩選及功能域確定.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Swine transmissible gastroenteritis，TGE)病原為豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)，臨床上以發(fā)熱、嘔吐、嚴重腹瀉、脫水和2周齡以內仔豬高死亡率為特征。目前，該病在多個國家均有報道，已成為大型養(yǎng)豬場仔豬腹瀉性死亡的主要原因之一，極大地限制了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。已有研究表明，TGEV感染可導致小腸上皮嚴重

2、病變，空腸回腸絨毛嚴重萎縮，同時可以促進腸系膜淋巴結細胞和樹突狀細胞產生IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α等大量的炎癥因子。由此可見，TGEV感染機體后誘導宿主產生的炎癥反應可能與其致病機制密切相關。NF-κB(Nuclear factor-kappa B)是一類在促炎癥基因表達過程中起到關鍵作用的核蛋白因子，具有多重轉錄調節(jié)作用，在病毒誘導的炎癥反應中發(fā)揮著關鍵作用。有研究表明TGEV感染能激活NF-κB信號通路，但TGEV誘

3、導炎癥反應的分子機制尚未確定。因此，本研究以確定TGEV感染細胞對NF-κB信號通路的調控作用為切入點，篩選TGEV激活NF-κB信號通路的關鍵蛋白，并進一步確定其激活NF-κB信號通路的關鍵功能域，以期為闡明TGEV誘導機體產生炎癥反應的信號轉導機制奠定基礎。
　　本實驗利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測TGEV感染豬睪丸細胞(Swine testicle，ST)對NF-κB信號通路的影響，結果表明，接種TGEV滴度的升高和TGEV感染

4、時間的增加均可導致雙熒光素酶活性比值的顯著升高，而紫外滅活的TGEV同對照組相比沒有明顯的變化;間接免疫熒光實驗(Indirect immunofluorescence assay，IFA)結果表明，TGEV感染可以促進p65發(fā)生核轉移。以上研究結果表明TGEV可以顯著激活NF-κB信號通路并且其激活作用與TGEV的滴度和復制密切相關。
　　為了進一步確定激活NF-κB信號通路的TGEV的關鍵蛋白，本研究通過RT-PCR的方法擴增

5、了TH-98株TGEV的Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7 Nsp8、 Nsp9、Nsp10、Nsp11+Nsp12、Nsp13、Nsp14、Nsp15、Nsp16、S基因、ORF3a、ORF3b、E基因、M基因、N基因、ORF7各基因片段并構建各段基因的真核表達載體，Western Blot和IFA實驗的結果表明TGEV各蛋白均在細胞中成功表達。利用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測TGEV各個蛋白對NF-κB信號

6、通路有影響，結果表明Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp6、Nsp14、ORF7均可激活NF-κB信號通路，其中，Nsp2的激活作用最為顯著。利用Western Blot和IFA檢測Nsp2對NF-κB信號通路經典途徑中的關鍵因子IκBα、p65的影響，結果表明Nsp2可促進IκBα的降解及p65的磷酸化、核轉移，由此可見，Nsp2可通過經典途徑激活NF-κB信號通路。
　　為確定TGEV Nsp2激活NF-κB信號通路的關鍵序列

7、，本研究通過構建包含TGEV Nsp2各個關鍵功能域的基因片段的真核表達載體，利用熒光素酶報告系統(tǒng)確定Nsp21-120位氨基酸是激活NF-κB信號通路的關鍵序列。
　　綜上所述，本研究證實了TGEV感染可以顯著激活NF-κB信號通路，并且其激活作用與TGEV的滴度和復制密切相關;TGEV Nsp2激活NF-κB信號通路的關鍵蛋白，其可通過誘導IκBα的降解、p65的磷酸化和核轉移來激活NF-κB信號通路;其中，1-120位氨基酸