一 人α-synuclein cDNA克隆及異源表達研究;二 Chloroperoxidase基因在畢赤酵母系統的表達研究.pdf

1、α-synuclein主要存在于中樞神經系統的突觸前末梢。該蛋白目前已受到國內外學者的普遍關注，主要原因在于發(fā)現它的功能異常與幾種神經退行性疾病，如帕金森氏病(parkinson’s disease，PD)、路易體癡呆(dementia with Lewy bodies，DLB)和老年性癡呆(Alzheimer’s disease，AD)有關。α-synuclein的生理功能至今仍不完全清楚。有一些報道顯示：α-synuclein與神經

2、細胞膜的穩(wěn)定性和可塑性有關，并具有抗神經細胞凋亡的作用和分子伴侶樣功能，它還參與了信號傳導過程。但其他一些報道則表明，它的異常積累和聚集將導致α-synuclein類疾病，如PD的發(fā)生，而且這是一個由環(huán)境或遺傳因素觸發(fā)的級聯(cascade)反應，包括α-synuclein的錯誤折疊與正常功能的喪失。在高濃度時，α-synuclein(以及它的突變體形式A53T和A30P)有自我聚集的傾向，導致寡聚體初原纖維、原纖維和多聚體的形成。有證

3、據顯示兩種突變體形成初原纖維的速率高于其野生型蛋白，而A30P形成原纖維的速率較低，A53T形成原纖維的速率較高。α-synuclein的寡聚體(protofibril)被認為具有神經細胞毒性，能引起細胞凋亡。鑒于α-synuclein具有上述病理學特征，且神經細胞內α-synuclein聚集體的形成又是幾種神經退行性疾病，如PD的一個特性，α-synuclein有可能被作為一個潛在的靶點用于新型抗PD藥物的尋找。 本文從人骨髓

4、神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y中成功克隆到α-synuclein編碼序列并完成A53T點突變，后者將被用于構建PD轉基因動物的表達載體。同時在畢赤酵母中成功表達了人α-synuclein的A53T突變蛋白，并初步觀察了A53T突變型α-synuclein在酵母細胞內表達對細胞生長的影響。 以多巴胺誘導的SH-SY5Y細胞總RNA為模板，應用RT-PCR方法擴增了人α-synuclein包含編碼區(qū)的cDNA片段，核苷酸序列分析表

5、明擴增片段與GenBank報道序列完全一致。將目的基因進行定點突變，使Ala53→Thr，將獲得的突變基因進行以下研究： 1)亞克隆到pcDNA3.0，構建含BGH polyA site的重組質粒，用于進一步構建PD轉基因動物重組表達質粒。每一步得到的亞克隆經序列測定與比對，準確無誤。 2)將α-synuclein A53T編碼區(qū)序列插入到畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K的α-因子信號肽編碼基因序列下游，構建重組質粒p

6、PIC9K-Sym；進一步構建含有綠色螢光蛋白(GFP)融合基因的重組質粒pPIC9K-SyGFP。重組質粒用Sac Ⅰ線性化后，采用電擊方法轉入畢赤酵母感受態(tài)(Pichia Pastoris GS115)細胞。利用MD培養(yǎng)基和含有G418的YPD培養(yǎng)基篩選出His<'+>Mut<'+>轉化子。轉化子經PCR鑒定后，用BMMYC培養(yǎng)基培養(yǎng)，以終濃度為1％(v/v)的甲醇誘導表達。發(fā)酵夜上清經過SDS-PAGE分析，發(fā)現轉入pPIC9K-

7、SyGFP的轉化子在40kDa處有特異蛋白條帶，而轉入pPIC9K-Sym的轉化子在20kDa處有蛋白條帶。Western blot實驗結果證實表達蛋白為重組人α-synuclein。 3)將α-synuclein A53T編碼區(qū)序列亞克隆到畢赤酵母胞內表達載體pPIC3.5K上，構建胞內重組表達質粒pPIC3.5K-Sym和pPIC3.5K-SyGFP，用上述方法轉化畢赤酵母感受態(tài)(PichiaPastoris GS115)細

8、胞并進行轉化子篩選。甲醇誘導表達后，用熒光顯微鏡觀察到含pPIC3.5K-SyGFP的重組菌株產生綠色熒光，根據熒光強度判斷，融合蛋白表達量很高，并且主要集中在細胞質。轉化子經液體及固體培養(yǎng)和甲醇誘導后，沒有見到細胞凋亡現象，生長反而比較旺盛，其原因可能在于轉化子尚缺乏一定的環(huán)境和遺傳方面的條件。鑒于某些基因缺失突變會顯著增加酵母對α-synuclein的敏感性(增強α-synuclein毒性)，對GS115/pPIC3.5K-SyGF