Hepcidin20基因克隆及在畢赤酵母中的表達.pdf

1、Hepcidin是一種低分子量的富含半胱氨酸的肝臟多肽激素，最初從人類血漿和尿液中分離得到。Hepcidin對體內鐵穩(wěn)態(tài)有重要調節(jié)作用，hepcidin的缺乏會導致多種疾病。另外，hepcidin在體外表現出良好的抗細菌及真菌活性?；瘜W合成及從組織中提取hepcidin成本較高且存在許多困難。至今，對于在真核生物中表達像hepcidin這樣的小分子多肽的報道還很少。 酵母像細菌一樣容易進行連續(xù)培養(yǎng)，與高等動物表達蛋白的方式相似，

2、因此在本研究中我們希望在酵母中高效表達有活性的重組hepcidin，在本研究中，我們在畢赤酵母中表達了人類hepcidin多肽，并對表達條件進行了優(yōu)化。 根據hepcidin的氨基酸序列以及畢赤酵母中密碼子的偏好性，合成了全長的hepcidin基因，克隆到酵母表達載體pPIC9K上并轉化畢赤酵母GS115菌株。在涂有合適濃度的遺傳霉素抗性平板上篩選轉化子，并經PCR驗證。在MM和MD平板上鑒定轉化予表型，驗證后發(fā)現均為His+M

3、ut+。 重組畢赤酵母菌株在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)（28℃，260 rpm），每24h加入0．5%的甲醇誘導。轉化空pPIC9K質粒的菌株作為對照。Tricine-SDS-PAGE顯示2．2kD條帶，表明異源蛋白在畢赤酵母中成功表達。多肽表達水平和活性分別通過SDS-PAGE和免疫反應檢測。 對重組酵母的培養(yǎng)及誘導條件進行了優(yōu)化。結果表明胰蛋白胨，酵母提取物，穩(wěn)定的PH對重組酵母生長和蛋白表達有顯著影響。28℃0．5%的甲

4、醇誘導48h，BMMY培養(yǎng)基與其他培養(yǎng)基相比（BMM和MM）最適合hepcidin表達。 收集誘導60 h的發(fā)酵液，重組多肽通過等電點沉淀和凝膠過濾色譜純化。含有hepcidin的部分通過反向HPLC進一步純化。另外，Hepcidin（11min）洗脫時間與化學合成的hepcidin相同。Hepcidin的分子量與計算的分子量（2191．77Da）一致。收集的每一部分通過ELISA驗證是否含有重組Hepc，并驗證得到的物質確實為