人apoA Ⅰ基因在巴斯德畢赤氏酵母中的表達(dá)研究.pdf

1、人載脂蛋白A Ⅰ(apolipoprotein A Ⅰ,ApoA Ⅰ)分子為243個(gè)氨基酸殘基組成的單一肽鏈,分子質(zhì)量為28.3 ku,主要在肝臟中合成,是高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)的重要組分,無(wú)糖基化修飾,具較強(qiáng)的疏水性[1,9].1992年上海醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院研究人員發(fā)現(xiàn)[2]ApoA Ⅰ能特異性地識(shí)別肝細(xì)胞表面受體.根據(jù)這一特性,可以將人血漿中提取的天然ApoA Ⅰ與卵磷脂、抗腫瘤藥物等

2、重組成復(fù)合物,通過(guò)ApoA Ⅰ將藥物靶向運(yùn)入肝癌細(xì)胞,對(duì)肝癌細(xì)胞有殺傷作用,這一研究已取得初步的成果.用基因工程方法制備ApoA Ⅰ,可克服從人血漿中制備ApoA Ⅰ產(chǎn)量低、步驟多、成本高的缺點(diǎn),有利于靶向藥物的大規(guī)模生產(chǎn).在之前的實(shí)驗(yàn)中我們?cè)诋叧嗍辖湍钢蟹置诒磉_(dá)了rApoA Ⅰ,但與標(biāo)準(zhǔn)蛋白相比,其N(xiāo)-末端不均一且C-末端缺失了部分氨基酸.為了解決這兩個(gè)問(wèn)題,我們將除去上游EAEA編碼序列的人工基因apoA Ⅰ<'D>和天然基因apo

3、A Ⅰ<'N>分別插入分泌型載體pPIC9K,將重組的pPIC9K-apoA Ⅰ<'D>和pPIC9K-apoA Ⅰ<'N>用BglⅡ酶切后,轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GS115和SMDll68菌株,篩選獲得G418高抗性轉(zhuǎn)化子.轉(zhuǎn)化子經(jīng)搖瓶發(fā)酵和甲醇誘導(dǎo),上清液用SDS-PAGE與Western blotting檢測(cè),有明顯的rApoA Ⅰ表達(dá),說(shuō)明去除部分信號(hào)肽酶識(shí)別序列后,并不影響rApoA Ⅰ的分泌表達(dá),但仍未能解決C-

4、末端降解的問(wèn)題.所以我們決定嘗試胞內(nèi)表達(dá)rApoA Ⅰ的路線:將PCR擴(kuò)增得到的apoA Ⅰ<'I>基因片段插入胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K,重組的pPIC3.5K-apoAⅠ<'I>用BglⅡ酶切后,轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GS115菌株,篩選獲得G418高抗性轉(zhuǎn)化子,再通過(guò)PCR鑒定證實(shí)apoA Ⅰ<'I>基因已整合到染色體上.其轉(zhuǎn)化子經(jīng)搖瓶發(fā)酵和甲醇誘導(dǎo),收集細(xì)胞裂解后,用SDS-PAGE與Western blottin