DCX和SPARC共表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和放射敏感性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建DCX和SPARC雙基因共表達(dá)腺病毒載體（Ad-DCX-SPARC），研究其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和放射敏感性的影響及其機(jī)制研究。
　　方法：
　　1.PCR擴(kuò)增獲得DCX和SPARC目的基因，構(gòu)建針對(duì) DCX和 SPARC的pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter-SPARC雙基因共表達(dá)重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒；
　　2.將構(gòu)建正確的pAdTrack-CMV-DCX-polyA+pro

2、moter-SPARC重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒經(jīng)PmeI酶切后與pAdEasy-1腺病毒骨架質(zhì)粒在BJ5183大腸桿菌中同源重組；
　　3.同源重組質(zhì)粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter-SPARC(簡(jiǎn)稱為pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC)經(jīng)PacI酶切后再用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞，經(jīng)多輪感染和擴(kuò)增后獲得Ad-DCX-polyA+promoter-SPARC(簡(jiǎn)稱

3、 Ad-DCX-SPARC)雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體；
　　4.將Ad-DCX-SPARC重組腺病毒體外感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和A172，篩選出Ad-DCX-SPARC的最佳感染劑量；
　　5.通過(guò)一系列檢測(cè)細(xì)胞增殖、侵襲和放射敏感性的實(shí)驗(yàn)方法，研究增加DCX和SPARC雙基因共表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和放射敏感性的影響，并分析其可能的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了雙啟動(dòng)子介導(dǎo)的DCX和SPARC

4、雙基因共表達(dá)腺病毒載體Ad-DCX-SPARC，其能高效感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和A172，最佳感染劑量分別為20MOI和100MOI；
　　2.腺病毒介導(dǎo)的DCX和SPARC雙基因共表達(dá)能明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，削弱SPARC促膠質(zhì)瘤侵襲的作用；
　　3.增加DCX-SPARC雙基因共表達(dá)能使U251和A172膠質(zhì)瘤細(xì)胞照射后克隆形成能力明顯降低；
　　4.單純?cè)黾覦CX和SPARC雙基因共表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡無(wú)明顯

5、影響，但聯(lián)合輻照后能明顯促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡；
　　5. DCX-SPARC雙基因共表達(dá)提高了照前G2期細(xì)胞的比例，聯(lián)合X射線照射后能減少照后G2期細(xì)胞的阻滯，從而減少了DNA損傷的修復(fù)，最終促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的死亡；
　　6.分子機(jī)制檢測(cè)結(jié)果表明Ad-DCX-SPARC聯(lián)合X射線照射能明顯上調(diào)U251和A172膠質(zhì)瘤細(xì)胞bax，bad的表達(dá)和下調(diào)bcl-2的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.成功獲得了DCX和SPARC

6、雙基因共表達(dá)腺病毒載體Ad-DCX-SPARC，能明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，削弱SPARC促膠質(zhì)瘤侵襲的作用；
　　2.DCX和SPARC雙基因共表達(dá)聯(lián)合X射線照射能通過(guò)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形成、提高照射前G2期細(xì)胞阻滯、增加輻照引起的細(xì)胞凋亡、使細(xì)胞照后G2期的阻滯得到減弱從而減少照后DNA損傷的修復(fù)等機(jī)制提高腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性；
　　3. Ad-DCX-SPARC聯(lián)合X射線照射可通過(guò)調(diào)節(jié)U251和A172細(xì)胞中ba