下調膠質瘤干細胞CXCR4表達對膠質瘤侵襲和血管生成能力的影響.pdf

1、隨著干細胞研究領域的飛速發(fā)展和實驗技術的進步，“腫瘤干細胞”理論再次引起人們的關注，并為越來越多的學者所接受。該理論認為：腫瘤是一個異質性的群體，只有腫瘤干細胞亞群具備自我更新、多向分化以及成瘤能力，而非腫瘤干細胞(包括祖細胞、分化的腫瘤細胞)則缺乏這些能力。研究者先后在白血病、乳腺癌、腦腫瘤、結腸癌、肝癌、前列腺癌等至少20類腫瘤中證實了腫瘤干細胞的存在，并對其多種重要的生物學特性進行了細致的觀察，包括治療抵抗性、促血管生成能力、侵襲

2、特性、免疫源性等。隨著研究的深入，越來越多的研究者相信，這群數(shù)量稀少、性質特殊的細胞，才是惡性腫瘤發(fā)生、進展以及治療后復發(fā)的根源，而探索針對腫瘤干細胞亞群的靶向治療措施，是今后惡性腫瘤治療的重要方向之一。 趨化因子受體CXCR4屬于7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體家族，可被其特異性配體SDF-1激活。CXCR4在多種腫瘤中都具有很強的促侵襲和促血管生成能力。在膠質瘤中，CXCR4的表達與腫瘤的級別呈正相關，其活化后可促進膠質瘤細胞侵襲，

3、并且活化后還可以通過上調膠質瘤細胞VEGF的分泌量來促進腫瘤的血管生成。近期的研究表明，從原代膠質瘤標本中獲取的膠質瘤干細胞高表達CXCR4。然而CXCR4在膠質瘤干細胞中的作用尚需進一步研究。 在本研究中，首先，采用間接免疫熒光標記驗證U87細胞及其顱內移植瘤標本中膠質瘤干細胞標記物CD133是否和CXCR4共表達。然后，我們采用si-RNA(小干擾RNA)下調U87細胞中CXCR4的表達，并且分別從穩(wěn)定轉染CXCR4小干擾R

4、NA質粒的U87細胞和穩(wěn)定轉染陰性對照質粒的U87細胞中培養(yǎng)出膠質瘤干細胞球，并對其進行鑒定，同時觀察兩者CXCR4的表達情況。在此基礎上我們進一步通過Transwell小室比較兩者的侵襲能力；采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測兩者細胞培養(yǎng)上清內VEGF的含量。我們還采用上述膠質瘤干細胞的裸鼠顱內移植瘤，在體內觀察其VEGF的分泌的情況和腫瘤的微血管密度的差別。主要的結果和結論如下： 1.U87細胞中膠質瘤干細胞的CXCR4

5、表達情況 用免疫熒光標記U87細胞及其瘤顱內移植瘤標本，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察CXCR4和CD133的表達情況。結果顯示，U87細胞及其建立的顱內移植瘤中均可以檢測到CD133和CXCR4雙陽性的膠質瘤干細胞 2.獲取穩(wěn)定轉染CXCR4干擾質粒的U87細胞 獲取穩(wěn)定轉染的細胞后，我們對干擾效果進行檢測了檢測。Western blot結果顯示，干擾組1細胞的CXCR4表達水平下降較明顯；干擾組2略有下降；而干擾組

6、3則幾乎沒有效果。我們選用干擾組1進行后續(xù)試驗，并用RT-PCR對其干擾效果從RNA水平進行了進一步的檢驗，結果表明干擾組CXCR4水平顯著下降。 3.膠質瘤干細胞球的篩選和鑒定 (1)用逐漸添加神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)基的方法，成功地分別從干擾組與對照組U87細胞中培養(yǎng)出膠質瘤干細胞球。在于細胞培養(yǎng)基中，分化的腫瘤細胞貼壁并且生長受到抑制，而GSCs能夠在培養(yǎng)基中呈克隆球樣懸浮生長。 (2)兩組膠質瘤干細胞球均表達膠

7、質瘤干細胞的標記物CD133和nestin，并且從干擾組U87細胞中獲得的膠質瘤干細胞球，其CXCR4的表達較對照組明顯降低。 4.下調CXCR4表達對膠質瘤干細胞趨化和侵襲能力的影響 (1)下調膠質瘤干細胞CXCR4表達后，體外趨化結果顯示，干擾組的膠質瘤干細胞轉移至微孔膜下表面的細胞數(shù)明顯少于對照組。在每個高倍鏡視野下，干擾組僅有60±7.3個細胞穿過微孔轉移至膜的下方，對照組卻有166±11.2個細胞轉移至膜的下方

8、(P<0.05)。 (2)體外侵襲試驗結果顯示，干擾組的膠質瘤干細胞轉移至微孔膜下表面的細胞數(shù)也少于對照組。干擾組為：17±5.8個/HPF，對照組為：71±8.7個/HPF(P<0.05)。 5.下調CXCR4表達抑制膠質瘤干細胞分泌VEGF (1)分別在24 h、48 h時用ELISA檢測各組膠質瘤干細胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量。結果顯示，下調膠質瘤干細胞CXCR4表達后，其VEGF的分泌量也隨之降低。在24

9、 h時干擾組和對照組VEGF的分泌量分別為690+24 pg/ml和850±25 pg/ml(P<0.05)，在48 h時干擾組和對照組VEGF的分泌量分別為1504±53 pg/ml和2001±150 pg/ml(P<0.05)。 (2)我們在進一步在體內對其進行驗證。結果顯示：干擾組膠質瘤干細胞建立的顱內移植瘤的微血管密度和VEGF的分泌量均小于對照組。 綜上所述，U87細胞中的膠質瘤干細胞上表達CXCR4，從干擾的

10、U87細胞中可以培養(yǎng)出膠質瘤干細胞，它們也表達膠質瘤干細胞的標記物，而且從干擾組中培養(yǎng)出的膠質瘤干細胞的CXCR4表達水平要低于對照組；此外，干擾組的膠質瘤干細胞的趨化和侵襲能力下降，同時其分泌VEGF的能力也低于對照組，并且干擾組膠質瘤干細胞建立的裸鼠顱內移植瘤模型中微血管密度和VEGF的分泌量也低于對照組。結果提示下調膠質瘤干細胞的CXCR4表達可以抑制膠質瘤干細胞的趨化和侵襲，并且可以下調其促血管生成能力。提示：CXCR4可能是膠