氫醌對L-02型人正常肝細胞蛋白質表達譜的影響.pdf

1、氫醌(Hydroquinone，HQ)又名對苯二酚(C6H6O2)，在工業(yè)生產中廣泛應用，日常生活中通過某些藥物、化妝品也可長時間接觸。HQ還是苯的代謝物之一，在苯毒性效應中發(fā)揮著重要作用。其主要職業(yè)接觸人群為氫醌或者苯的生產工人，照相顯影操作工，橡膠、塑料穩(wěn)定劑操作工等。HQ經消化道、呼吸道和皮膚吸收，廣泛分布于各臟器組織，主要在肝內代謝，大部分與葡萄糖醛酸或硫酸鹽形成結合物，經尿排出而解毒；部分富集于骨髓組織，再進一步代謝生成對苯半

2、醌和對苯醌。HQ在體內代謝活化產生一系列毒害反應，危害人類尤其是職業(yè)接觸者的健康。人群流行病學調查及實驗動物研究均發(fā)現(xiàn)長期接觸HQ可對肝、腎、骨髓造血系統(tǒng)等造成損傷，表現(xiàn)為血細胞數(shù)量減少，肝腎重量增加等；而且還揭示其HQ潛在致癌性，表現(xiàn)為肝細胞腺瘤、腎小管細胞腺瘤等。HQ對人體的毒害作用以視覺系統(tǒng)較為敏感，引起視力下降，眼結膜和角膜的損傷。此外還可引起皮膚刺激反應，長期接觸可導致外源性黃褐病。 關于HQ毒作用機制的研究顯示，HQ

3、可以導致DNA損傷、染色體畸變、誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖等，但是這些研究局限于人為地選取一個或少數(shù)幾個指標進行分析，不能從整體水平上對HQ的毒作用機制作出較為系統(tǒng)的解釋，而且鮮見蛋白質水平的研究。近年來，基因組研究由結構基因組轉為功能基因組，高通量掃描技術(包括基因組和蛋白質組分析技術)已被引入職業(yè)病研究領域。這些技術可以從基因組或蛋白質組水平揭示外界刺激對細胞基因轉錄或蛋白質表達的影響，“中性”地反映該因素的生物學效應，為作用機制的

4、探討提供新的思路。為此，本學位論文計劃采用蛋白質雙向凝膠電泳結合質譜技術研究HQ刺激后人肝細胞蛋白質譜的表達變化，以期發(fā)現(xiàn)可能的HQ毒作用敏感反應蛋白質，從蛋白質組學角度探索HQ毒作用機制，并為HQ接觸者職業(yè)病的診斷和防治及進一步完善HQ的職業(yè)衛(wèi)生標準提供基礎資料。 為實現(xiàn)以上目的，我們首先使用雙向凝膠電泳技術分離蛋白。體外傳代培養(yǎng)的L-02型肝細胞分2組，處理組經HQ(濃度為1×10-4mol/L)染毒24h，對照組不做處理。

5、然后同時提取蛋白進行雙向凝膠電泳，一向采用IPG17cm，pH5-8的膠條，二向使用12％的SDS-PAGE凝膠。電泳后的凝膠用銀染方法進行染色，并用GS800掃描儀掃描，圖譜經PDQuest7.1軟件分析，建立化學物質HQ實驗組和對照組的細胞蛋白質差異表達圖譜。實驗獨立進行3次，每次實驗處理組和對照組各設3塊膠作為組內重復。結果顯示，每塊膠檢測到1000個左右的蛋白點，實驗組和對照組凝膠匹配率組內達90％以上，組間80％以上，3次實驗

6、各發(fā)現(xiàn)17、18、24個蛋白點表達改變，表達量上調或者下調2倍及以上，其中4個蛋白點在3次獨立實驗中均出現(xiàn)。然后切取這4個重復性較好的差異蛋白點，用特異性的胰酶膠內消化，酶解后的肽段采用Voyager-DESTRMALDI-TOF質譜儀進行MALDI-TOF質譜分析。把得到的蛋白質各肽段質荷比經過胰酶自切峰作為內標進行校正，再去除污染峰、酶切峰等，綜合所得肽段信息使用Mascot搜索NCBI人類蛋白質數(shù)據(jù)庫，誤差為100ppm。4個蛋白

7、分別是RhoGDP解離抑制蛋白(RhoGDPdissociationinhibitorGDIalpha)，6-磷酸葡萄糖內酯酶(6-phosphogluconolactonase)，erbB3結合蛋白EBP1(erbB3bindingproteinEBP1)和核纖層蛋白(laminA/C，isoform1precursor)。這些蛋白與信號轉導、細胞凋亡及能量代謝等密切相關。為進一步驗證雙向凝膠電泳和質譜鑒定結果的準確性，我們選取蛋白E

8、BP1使用傳統(tǒng)方法WesternBlot進行驗證，結果表明HQ處理后肝細胞內EBP1蛋白表達下調，與上述方法得到的結果一致。 綜上所述，我們認為，HQ作為一種職業(yè)危害因素可以引起肝細胞蛋白質表達譜變化，是其發(fā)生毒性效應機制之一。實驗中鑒定到的數(shù)個蛋白與血液系統(tǒng)損傷有著直接或者間接的聯(lián)系，但是這些蛋白在血液系統(tǒng)細胞中的表達情況尚待研究。運用雙向凝膠電泳結合質譜分析的方法能有效分離鑒定暴露于HQ后肝細胞差異表達的蛋白質，方法可行，結