抑瘤基因NGX6對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響.pdf

1、結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤，其發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重地威脅著人類健康。結(jié)腸癌是一個(gè)多基因、多階段逐步演變的病理過(guò)程，其中抑瘤基因的失活和瘤基因的異常激活在結(jié)腸癌的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移等過(guò)程發(fā)揮重要作用，因而尋找鑒定有價(jià)值的結(jié)腸癌相關(guān)抑瘤基因/易感基因，闡明其分子機(jī)制對(duì)揭示結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制，建立有效的分子診治方法至關(guān)重要。 NGX6基因是中南大學(xué)腫瘤研究所分子遺傳室采用定位侯選克隆策略克隆的基因（基因登錄號(hào)：AF188239

2、），定位于染色體9p21-22，cDNA全長(zhǎng)2.1kb，生物信息學(xué)分析該基因編碼一個(gè)338個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，具有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，一個(gè)EGF-Like domain，多個(gè)糖基化位點(diǎn)和多個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。9p21-22區(qū)域等位基因雜合性缺失（loss of heteroaygosity，LOH）現(xiàn)象是多種腫瘤中的共同事件，提示該基因?yàn)橐荒[瘤相關(guān)基因。 在前期研究發(fā)現(xiàn)：NGX6在不同分期的結(jié)直腸癌中存在不同程度的表達(dá)下調(diào)，尤其在

3、有轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌中其下調(diào)率高達(dá)93.7％。通過(guò)細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、MTT比色法、軟瓊脂集落形成、裸鼠接種等實(shí)驗(yàn)表明NGX6基因可逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性表型；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NGX6可延緩結(jié)腸癌細(xì)胞從G0/G1期向S期的進(jìn)程，并可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡；體外侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)和劃痕標(biāo)記染料發(fā)現(xiàn)NGX6可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。NGX6基因的上述生物學(xué)效應(yīng)提示：NGX6在結(jié)腸癌中發(fā)揮著抑瘤作用。我們進(jìn)一步采用基因芯片技術(shù)分析NGX6對(duì)結(jié)腸癌

4、細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，結(jié)果提示NGX6可能調(diào)控EGFR介導(dǎo)的JNK通路和Wnt/β-catenin等信號(hào)通路的活性而發(fā)揮抗腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移作用；通過(guò)EMSA發(fā)現(xiàn)NGX6可能通過(guò)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞NF-κB的激活而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡；免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)NGX6與ezrin蛋白結(jié)合，ezrin是一個(gè)“橋梁”蛋白，連接膜蛋白與細(xì)胞骨架，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、信號(hào)傳導(dǎo)兩條通路上都扮演著重要角色，這一結(jié)果表明NGX6在調(diào)控細(xì)胞黏附及運(yùn)動(dòng)中可能占有重要地位。上述研

5、究強(qiáng)烈提示NGX6在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑瘤作用，基因水平的研究提示其抑瘤機(jī)制可能為NGX6結(jié)合ezrin負(fù)調(diào)控EGFR介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路的活性而發(fā)揮其生物學(xué)功能。 研究目的： 生命的最終執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，NGX6基因?qū)Y(jié)腸癌中蛋白質(zhì)組的調(diào)控作用如何呢？這是本課題的切入點(diǎn)，目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，分析結(jié)腸癌細(xì)胞中NGX6轉(zhuǎn)染前后的差異蛋白表達(dá)譜，在蛋白質(zhì)水平闡明NGX6基因抑瘤的主要機(jī)制。 研究方法

6、： 應(yīng)用熒光差異凝膠電泳（DIGE）和質(zhì)譜分析技術(shù)比較結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中NGX6轉(zhuǎn)染前后的蛋白質(zhì)譜的表達(dá)變化。具體方法：1）提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，并進(jìn)行Clean-up處理、測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，進(jìn)行2D-DIGE電泳，利用Typhone掃描儀獲取圖像，Labscan掃面軟件掃描進(jìn)行圖譜分析。2）經(jīng)過(guò)圖譜分析，以大于1.8倍為標(biāo)準(zhǔn)選取差異蛋白點(diǎn)，挖點(diǎn)，酶解，質(zhì)譜鑒定差異蛋白質(zhì)。通過(guò)查找差異蛋白質(zhì)生物信息學(xué)功能，明確NGX6在蛋白質(zhì)水平對(duì)

7、結(jié)腸癌的抑瘤機(jī)制。 研究結(jié)果： 結(jié)果篩選到12個(gè)下調(diào)蛋白：nucleolin、90kDa heat shockprotein、tubulin、HNRPH1、Annexin A2、HCRTR1 protein、microtubule-associated protein6 isoform1、guanine nucleotidebinding protein，beta-2 subunit、Chain A，Crystal St

8、ructure OfA Soluble Dimeric Form Of Oxidised Clicl、Chain A，MolecularBasis For The Recognition Of Phosphorylated AndPhosphoacetylated Histone H3 By、Chain A，Molecular Basis for the Local Confomational Rearrangement Of Huma

9、n PhosphoserinePhosphata等，4個(gè)上調(diào)蛋白：aldehyde dehydrogenase1、ChainA，X-Ray Structure Of A Deletion Variant Of Human Glucose6-Phosphate Dehydrogenase Complexe、phosphoglycerate mutase1（brain）、fatty acid binding protein5（psorias

10、is-associated）等。并通過(guò)Western印跡驗(yàn)證了分子伴侶HSP90和AnnexinⅡ在NGX6基因轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞后的表達(dá)變化，與質(zhì)譜分析結(jié)果一致。生物信息學(xué)分析上述蛋白的功能，發(fā)現(xiàn)其均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，按功能分類包括：細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞代謝。這些基因涉及到與腫瘤增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路：如JNK/SAPK信號(hào)通路，Raf-1/MAPK信號(hào)通路，IKK/NF-κB信號(hào)通路

11、，PI3K-Akt信號(hào)通路，凋亡信號(hào)通路Bcl-2家族以及Fas凋亡途徑等信號(hào)通路。這些通路間通過(guò)“中間分子”形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)。 結(jié)論： 在結(jié)腸癌細(xì)胞中NGX6基因可改變細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白分子的表達(dá)，通過(guò)影響這些蛋白分子可能調(diào)控MAPK、IKK/NF-κB、PI3K-Akt及凋亡通路的活性而發(fā)揮其抗腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。下一步的工作我們將深入揭示NGX