周期性張應力對大鼠生長板軟骨細胞的作用及相關機制.pdf

1、目的：
　　1.研究大鼠生長板軟骨細胞和骨髓間充質干細胞的體外三維培養(yǎng)和共培養(yǎng)，并探討兩者作為組織工程種子細胞的優(yōu)缺點。
　　2.研究周期性張應力對大鼠生長板軟骨細胞增殖的影響及ERK和YAP蛋白的作用。
　　3.觀察FAK、細胞骨架F-actin和RhoA通路在周期性張應力對大鼠生長板軟骨細胞力學傳導中的作用。
　　方法：
　　1.分別取大鼠生長板軟骨細胞和骨髓間充質干細胞，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。骨髓間充

2、質干細胞行三系分化誘導并檢測分化能力。將細胞行3D培養(yǎng)和共培養(yǎng)，實驗分三組：生長板軟骨細胞單獨培養(yǎng)組、骨髓間充質干細胞單獨培養(yǎng)組和共培養(yǎng)組。Real-time PCR檢測三組細胞成軟骨分化基因的表達，免疫組織化學方法檢測細胞外基質的表達情況。
　　2.采用四點彎曲張力儀，對體外培養(yǎng)的大鼠生長板軟骨細胞行周期性張應力，Western Blot檢測YAP和ERK蛋白的活化及細胞增殖相關蛋白PCNA和CyclinD1的表達，Real-t

3、ime PCR檢測C-Fos和CTGF基因的表達。阻斷細胞ERK或YAP蛋白的活性，Western Blot和流式細胞術檢測力學刺激對細胞增殖作用的改變。
　　3.對大鼠生長板軟骨細胞行周期性張應力，Western Blot檢測FAK和RhoA蛋白的表達。免疫熒光觀察應力對細胞骨架F-actin的作用。阻斷細胞FAK或RhoA活性，以及抑制細胞骨架F-actin聚集，Western Blot檢測張應力對YAP和ERK蛋白表達的變化

4、。
　　結果：
　　1.大鼠生長板軟骨細胞呈三角形或短梭形，而大鼠骨髓間充質干細胞呈長梭形。骨髓間充質干細胞具有三系分化的能力。盡管早期共培養(yǎng)組成軟骨分化能力要強于其他兩組，但后期大鼠生長板軟骨細胞單獨培養(yǎng)組的成軟骨分化能力最強。
　　2.大鼠生長板軟骨細胞在受到3000μstrain、0.5Hz的張應力刺激1h時，YAP和ERK蛋白的活性最高，C-Fos和CTGF基因mRNA表達水平也最高。適宜的力學刺激能促進細胞增

5、殖，改變細胞周期，并且抑制YAP和ERK的活性可阻斷該作用。
　　3.周期性張應力能促進大鼠生長板軟骨細胞FAK和RhoA蛋白的活化，以及細胞骨架F-actin聚集。給予細胞PF573228、C3toxin以及細胞骨架松弛素D，可阻斷應力活化YAP和ERK蛋白。
　　結論：
　　1.大鼠生長板軟骨細胞和骨髓間充質干細胞作為組織工程的種子細胞各自有優(yōu)缺點，3D培養(yǎng)和共培養(yǎng)有益于生長板組織工程的發(fā)展。
　　2.周期性