巨噬細胞培養(yǎng)上清液與周期性拉伸應力對大鼠雪旺細胞的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
   周圍神經(jīng)損傷是一種很發(fā)生率較高的致殘因素,周圍神經(jīng)一旦損傷,功能恢復十分緩慢,甚至會造成永久的功能障礙。因此,周圍神經(jīng)損傷后的治療和康復研究是擺在廣大醫(yī)學工作者面前的一大難題,不論是病理機制還是治療手段,都是神經(jīng)科學領域的研究熱點。
   周圍神經(jīng)由結締組織和神經(jīng)構成。結締組織和神經(jīng)的聯(lián)系相當密切。由于終板離胞體較遠,神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)軸突一般都非常細而長。軸突之間彼此隔離而又成簇生長。神經(jīng)軸突的保護主要有三

2、層結締組織,由內而外分別稱為神經(jīng)內膜、神經(jīng)束膜和神經(jīng)外膜。神經(jīng)束膜包繞神經(jīng)軸突、雪旺細胞和神經(jīng)內膜而形成神經(jīng)束。神經(jīng)外膜包繞幾條神經(jīng)束而形成神經(jīng)。
   神經(jīng)損傷后機體修復的第一步則是神經(jīng)元胞體的增大、尼氏小體的崩解、細胞核移至細胞周邊,并啟動相關蛋白合成。由于遠端神經(jīng)因為營養(yǎng)障礙甚至中斷,細胞質凝結、液化,軸突脫髓鞘崩解,于是出現(xiàn)周圍神經(jīng)特征性的Wallerian退變。
   當Wallerian退變過程一開始,局部雪

3、旺細胞即被激活,開始增殖。同時,在損傷部位出現(xiàn)大量募集的巨噬細胞。巨噬細胞主要由血液中的單核細胞趨化而來。損傷部位局部的雪旺細胞和募集的巨噬細胞將吞噬軸突和髓鞘碎片。髓鞘碎片的清除對于神經(jīng)的修復十分重要,因為髓鞘含有軸突生長的抑制因子,很有可能妨礙神經(jīng)再生。周圍神經(jīng)損傷后,雪旺細胞和巨噬細胞相互作用,對神經(jīng)再生具有非常重要的意義。
   Wallerian退變使得遠端的軸突和髓鞘退變而崩解,但雪旺細胞卻很少壞死。周圍神經(jīng)在再生修

4、復過程中,雪旺細胞具有非常重要的作用。研究表明,雪旺細胞不僅可以清除Wallerian退變崩解的產(chǎn)物和使髓鞘再形成,還能表達促進軸突生長的多種營養(yǎng)生長因子,并對軸突起到黏附和趨化生長的作用。
   神經(jīng)生長因子NGF是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一。周圍神經(jīng)損傷后,雪旺細胞大量增殖并分泌NGF,在損傷的局部形成高濃度的NGF而促進神經(jīng)再生。Laminin是雪旺細胞基質膜的主要成分,能調控雪旺細胞的存活與功能,引導雪旺細胞從高濃

5、度向低濃度處遷移。因此,雪旺細胞在周圍神經(jīng)損傷后的作用是多樣性的,能在周圍神經(jīng)損傷后形成對神經(jīng)修復再生有利的微環(huán)境,促進神經(jīng)再生。
   另一方面,機體組織和器官時刻接受著各種不同性質的力學刺激。物理力學刺激加載于器官,可以在細胞及基因水平影響其功能。機體的細胞在承受各種力學刺激的同時,也對這些刺激做出各種生物化學的、生物力學的以及生物電生理的反應。這些反應在細胞水平對組織和器官造成各種不同的影響。
   實驗證明,力學

6、刺激加載于細胞能產(chǎn)生多種影響,包括細胞的定向分化、影響細胞增殖和遷移、增加細胞外基質的形成、改變細胞排列以及細胞形態(tài)學改變,增強細胞信號轉導等等。
   同樣地,周圍神經(jīng)在不同情況下承受著不同程度的力學刺激,包括周圍神經(jīng)在行使其正常功能時,為調節(jié)各種姿勢和動作,也承受著多種力學刺激。在正常生理情況下,周圍神經(jīng)所受的力學刺激大概可以分為三種:擠壓力、剪切力和拉伸力。由于擠壓力和剪切力作用于周圍神經(jīng)的研究模式還不是很成熟,或是這兩種

7、作用力對于神經(jīng)的作用比壓力較復雜,所以通常對于拉伸應力研究得比較多。
   目前,拉伸應力加載在神經(jīng)功能康復、神經(jīng)延長術等領域研究廣泛。因此,充分研究正常和損傷的神經(jīng)的生物力學屬性以及日?;顒铀鸬牧W應變,有利于診斷疾病和指導物理治療。
   拉伸應力加載可以平行或者垂直于神經(jīng)長軸施加于神經(jīng),引起相應的縱向或者橫向的壓力。由縱向拉伸應力引起的神經(jīng)長度改變叫做拉伸形變(strain),以延長的百分數(shù)來表示。神經(jīng)在拉伸的

8、過程中,橫截面積減小。有理論模型研究發(fā)現(xiàn),當神經(jīng)處于拉伸應力情況下,神經(jīng)外面包裹的結締組織管或結締組織鞘對神經(jīng)的生物力學特性有十分重要的影響。結締組織的結構改變能夠影響神經(jīng)的順應性。影響神經(jīng)順應性的因素有很多,比如神經(jīng)束的數(shù)量,束膜外結締組織的橫截面積等等。另外,拉伸速度、拉伸力維持的時間以及重復拉伸都能改變神經(jīng)的順應性。
   全身的非特異性結締組織與神經(jīng)緊密聯(lián)系,相互影響,組成了一個遍布全身的“信息網(wǎng)絡”,對機體全身功能活動

9、進行調控。而巨噬細胞也是筋膜結締組織中的重要細胞成分,且在周圍神經(jīng)損傷修復中發(fā)揮著重要作用。本實驗室既往也對巨噬細胞與雪旺細胞共培養(yǎng)進行了相關研究,但都是在靜態(tài)培養(yǎng)條件下進行的實驗。本課題組前期研究也表明,拉伸刺激能夠使筋膜結締組織重構,并在基因水平對組織細胞產(chǎn)生影響。此外,有研究表明拉伸應力也能影響雪旺細胞的增殖、基因表達。然而,拉伸應力加載于與巨噬細胞培養(yǎng)上清液共培養(yǎng)的雪旺細胞會產(chǎn)生怎樣的影響?這個疑問至今無人解答。本研究,我們采用

10、雪旺細胞和巨噬細胞上清液共培養(yǎng)模型,能更好地模擬周圍神經(jīng)受損后的內環(huán)境,并采用周期性拉伸應力加載,在細胞增殖和遷移以及基因表達方面進行探索。
   目的:
   研究腹腔來源巨噬細胞培養(yǎng)上清液和周期性拉伸應力對RSC96細胞的影響,為周期性拉伸應力干預周圍神經(jīng)的損傷修復提供基礎實驗支持。
   方法:
   1.為獲取巨噬細胞培養(yǎng)上清液,向SD大鼠腹膜腔內注射DMEM/F12培養(yǎng)液約10 ml,約10 m

11、in后抽出腹膜腔細胞懸液,離心后接種于培養(yǎng)板,用差速貼壁法獲得腹腔來源的巨噬細胞。采用CD68和CD11b對細胞進行標記,流式細胞儀進行細胞鑒定。每隔8小時收集其培養(yǎng)上清液,儲存以供共培養(yǎng)使用。
   2.將RSC96大鼠雪旺細胞均勻接種在六孔拉伸培養(yǎng)板上,分為四組:A組:RSC96(對照組),B組:共培養(yǎng)組,C組:拉伸組,D組:拉伸共培養(yǎng)組。共培養(yǎng)指RSC96雪旺細胞株與巨噬細胞培養(yǎng)上清液共培養(yǎng)。拉伸即周期性拉伸應力加載。

12、r>   周期性拉伸應力加載采用Flexcell FX-5000 Tension System應力加載系統(tǒng)。本次實驗使用圓柱形應力加載平臺,提供雙軸向應力,由系統(tǒng)自帶的電腦軟件對應力進行參數(shù)控制。具體設置為:正弦波,025Hz,最大拉伸形變?yōu)?%,每次持續(xù)時間1小時,每隔12小時拉伸一次。拉伸組一共拉伸處理5次。
   3.于第3天收集各組細胞,采用MTT法檢測每組細胞的增殖情況。應用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測570 nm處各孔的吸光

13、值進行統(tǒng)計分析。用劃痕實驗進行每組細胞遷移能力測試,在處理前、后分別使用相差顯微鏡隨機視野拍照,用ImageJ軟件進行結果分析。
   4.用Trizol法提取總RNA,進行qPCR實驗檢測每組細胞所含NGF和Laminin的mRNA含量。
   5.用Western Blot法檢測每組細胞所含NGF和Laminin蛋白的表達情況,用ImageJ軟件進行灰度值分析。
   6.重復三次實驗所得結果應用SPSS13

14、.0軟件進行統(tǒng)計分析,對所測得的結果進行正態(tài)性及方差齊性檢驗。多組間比較采用單因素方差分析,若方差齊,組間比較則用LSD檢驗,方差不齊選用Dunnett's T3檢驗。檢驗水準為α=0.05,P<0.05認為有顯著差異。
   結果:
   1.流式細胞鑒定結果顯示,表達CD68和CD11b的細胞占90%,達到滿意的陽性率。說明這種方法是獲得腹腔巨噬細胞的簡便可靠方法。
   2.四組細胞于第3天進行MTT檢測,

15、細胞增殖結果顯示拉伸共培養(yǎng)組最高,拉伸組>共培養(yǎng)組>對照組。經(jīng)SPSS13.0軟件進行One-way ANOVA分析,顯示組間比較有顯著差異(F=28.833,P=0.000)。后續(xù)LSD檢驗發(fā)現(xiàn)處理組與對照組相比,均具有顯著差異(P值分別為0.034,0.000,0.000)。說明腹腔來源的巨噬細胞培養(yǎng)上清液與RSC96雪旺細胞共培養(yǎng),以及5%的拉伸形變的周期性拉伸應力加載對RSC96雪旺細胞都具有明顯的促進增殖的作用。處理組進行兩兩

16、比較,B、C兩組間C組高于B組,具有顯著差異(P=0.009)。這說明在5%的拉伸形變的周期性拉伸應力對RSC96雪旺細胞的增殖促進作用要優(yōu)于共培養(yǎng)。B組和D組比較,D組高于B組,有顯著差異(P=0.000)。同樣說明,在腹腔巨噬細胞上清液共培養(yǎng)條件下,周期性拉伸應力加載能明顯促進RSC96雪旺細胞的增殖。而C、D兩組比較發(fā)現(xiàn),D組高于C組,具有顯著差異(P=0.026),說明同樣在周期性拉伸應力加載條件下,共培養(yǎng)組增殖比單純應力加載要

17、明顯。這兩個結果也證明,周期性拉伸應力的加載和腹腔巨噬細胞上清液共培養(yǎng)對于RSC96雪旺細胞的增殖,兩者可能具有協(xié)同效應。
   3.為了測試不同處理組的細胞遷移情況,我們進行了劃痕實驗。經(jīng)過3天不同的處理之后,四組與處理前相比,空白面積顯著減少(P=0.000)。B、C、D組空白區(qū)域面積值與A組相比,均顯著減少(P=0.000),說明細胞遷移明顯增強。One-way ANOVA進行組間比較,顯示有顯著差異(F=571.670,

18、P=0.000)。進一步進行LSD檢驗分析發(fā)現(xiàn),除了處理后的B、C兩組之間相比,P=0.063(P>0.05)外,其余兩兩比較均有顯著差異(P=0.000)。說明巨噬細胞共培養(yǎng)和周期性拉伸應力加載都對RSC96雪旺細胞的遷移具有促進作用,但其效應可能沒有明顯的差別。然而D組與B、C兩組比較均有顯著差異(P=0.000),D組高于B、C兩組,說明這兩種處理條件對雪旺細胞的遷移可能具有協(xié)同促進作用。
   4.經(jīng)過3天不同的處理,分

19、別用qPCR和Western blot法檢測每組所含NGF的mRNA和蛋白表達。qPCR結果表明各組均比A組高,并具有顯著性差異(P值分別為0.002,0.006,0.002)。同時,B、C、D三組NGF蛋白表達相比,均比A組高,也具有顯著差異(P=0.000)。說明腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清液和周期性拉伸應力加載都能顯著提高NGF mRNA和蛋白的表達水平。qPCR結果顯示B組和C、D組之間沒有顯著性差異,P值分別為0.463和0.948。

20、C組和D組之間也沒有顯著差異,P=0.502。Western blot檢測則發(fā)現(xiàn)B、C、D三組之間NGF蛋白表達有顯著差異(P=0.000),D組表達最高,C組高于B組,說明周期拉伸應力加載促進NGF蛋白的表達效應可能要優(yōu)于共培養(yǎng),這兩種處理因素對RSC96細胞的NGF蛋白表達可能具有協(xié)同促進作用。
   5.經(jīng)過3天不同的處理,分別用qPCR和Western blot法檢測每組所含Laminin的mRNA和蛋白表達。qPCR結

21、果顯示B、C、D三組細胞Laminin的mRNA表達與A組相比,均比A組表達高,并具有顯著差異(P值分別為0.003,0.005,0.000)。B、C兩組之間比較P=0.736,兩者沒有顯著性差異。而D組分別和B、C兩組相比,有顯著差異,P值分別為0.049,0.028。Western blot結果用LSD法進行各組間比較,均有顯著性差異(P=0.000)。說明巨噬細胞培養(yǎng)上清液和周期性拉伸應力加載條件下,均能明顯促進雪旺細胞Lamin

22、in的表達。巨噬細胞共培養(yǎng)和周期性拉伸應力對雪旺細胞Laminin表達可能具有協(xié)同促進作用。
   結論:
   1.腹腔來源的巨噬細胞培養(yǎng)上清液與RSC96雪旺細胞共培養(yǎng),能明顯促進雪旺細胞增殖和遷移,并能明顯促進雪旺細胞表達NGF和Laminin。
   2.周期性拉伸應力加載于RSC96雪旺細胞,能能明顯促進雪旺細胞增殖和遷移,并能明顯促進雪旺細胞表達NGF和Laminin。
   3.巨噬細胞培養(yǎng)

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