巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液與周期性拉伸應(yīng)力對大鼠雪旺細(xì)胞的影響.pdf

1、背景:
　　 周圍神經(jīng)損傷是一種很發(fā)生率較高的致殘因素，周圍神經(jīng)一旦損傷，功能恢復(fù)十分緩慢，甚至?xí)斐捎谰玫墓δ苷系K。因此，周圍神經(jīng)損傷后的治療和康復(fù)研究是擺在廣大醫(yī)學(xué)工作者面前的一大難題，不論是病理機(jī)制還是治療手段，都是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　 周圍神經(jīng)由結(jié)締組織和神經(jīng)構(gòu)成。結(jié)締組織和神經(jīng)的聯(lián)系相當(dāng)密切。由于終板離胞體較遠(yuǎn)，神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)軸突一般都非常細(xì)而長。軸突之間彼此隔離而又成簇生長。神經(jīng)軸突的保護(hù)主要有三

2、層結(jié)締組織，由內(nèi)而外分別稱為神經(jīng)內(nèi)膜、神經(jīng)束膜和神經(jīng)外膜。神經(jīng)束膜包繞神經(jīng)軸突、雪旺細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)膜而形成神經(jīng)束。神經(jīng)外膜包繞幾條神經(jīng)束而形成神經(jīng)。
　　 神經(jīng)損傷后機(jī)體修復(fù)的第一步則是神經(jīng)元胞體的增大、尼氏小體的崩解、細(xì)胞核移至細(xì)胞周邊，并啟動相關(guān)蛋白合成。由于遠(yuǎn)端神經(jīng)因為營養(yǎng)障礙甚至中斷，細(xì)胞質(zhì)凝結(jié)、液化，軸突脫髓鞘崩解，于是出現(xiàn)周圍神經(jīng)特征性的Wallerian退變。
　　 當(dāng)Wallerian退變過程一開始，局部雪

3、旺細(xì)胞即被激活，開始增殖。同時，在損傷部位出現(xiàn)大量募集的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞主要由血液中的單核細(xì)胞趨化而來。損傷部位局部的雪旺細(xì)胞和募集的巨噬細(xì)胞將吞噬軸突和髓鞘碎片。髓鞘碎片的清除對于神經(jīng)的修復(fù)十分重要，因為髓鞘含有軸突生長的抑制因子，很有可能妨礙神經(jīng)再生。周圍神經(jīng)損傷后，雪旺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相互作用，對神經(jīng)再生具有非常重要的意義。
　　 Wallerian退變使得遠(yuǎn)端的軸突和髓鞘退變而崩解，但雪旺細(xì)胞卻很少壞死。周圍神經(jīng)在再生修

4、復(fù)過程中，雪旺細(xì)胞具有非常重要的作用。研究表明，雪旺細(xì)胞不僅可以清除Wallerian退變崩解的產(chǎn)物和使髓鞘再形成，還能表達(dá)促進(jìn)軸突生長的多種營養(yǎng)生長因子，并對軸突起到黏附和趨化生長的作用。
　　 神經(jīng)生長因子NGF是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一。周圍神經(jīng)損傷后，雪旺細(xì)胞大量增殖并分泌NGF，在損傷的局部形成高濃度的NGF而促進(jìn)神經(jīng)再生。Laminin是雪旺細(xì)胞基質(zhì)膜的主要成分，能調(diào)控雪旺細(xì)胞的存活與功能，引導(dǎo)雪旺細(xì)胞從高濃

5、度向低濃度處遷移。因此，雪旺細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷后的作用是多樣性的，能在周圍神經(jīng)損傷后形成對神經(jīng)修復(fù)再生有利的微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)再生。
　　 另一方面，機(jī)體組織和器官時刻接受著各種不同性質(zhì)的力學(xué)刺激。物理力學(xué)刺激加載于器官，可以在細(xì)胞及基因水平影響其功能。機(jī)體的細(xì)胞在承受各種力學(xué)刺激的同時，也對這些刺激做出各種生物化學(xué)的、生物力學(xué)的以及生物電生理的反應(yīng)。這些反應(yīng)在細(xì)胞水平對組織和器官造成各種不同的影響。
　　 實驗證明，力學(xué)

6、刺激加載于細(xì)胞能產(chǎn)生多種影響，包括細(xì)胞的定向分化、影響細(xì)胞增殖和遷移、增加細(xì)胞外基質(zhì)的形成、改變細(xì)胞排列以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，增強(qiáng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等等。
　　 同樣地，周圍神經(jīng)在不同情況下承受著不同程度的力學(xué)刺激，包括周圍神經(jīng)在行使其正常功能時，為調(diào)節(jié)各種姿勢和動作，也承受著多種力學(xué)刺激。在正常生理情況下，周圍神經(jīng)所受的力學(xué)刺激大概可以分為三種:擠壓力、剪切力和拉伸力。由于擠壓力和剪切力作用于周圍神經(jīng)的研究模式還不是很成熟，或是這兩種

7、作用力對于神經(jīng)的作用比壓力較復(fù)雜，所以通常對于拉伸應(yīng)力研究得比較多。
　　 目前，拉伸應(yīng)力加載在神經(jīng)功能康復(fù)、神經(jīng)延長術(shù)等領(lǐng)域研究廣泛。因此，充分研究正常和損傷的神經(jīng)的生物力學(xué)屬性以及日?；顒铀鸬牧W(xué)應(yīng)變，有利于診斷疾病和指導(dǎo)物理治療。
　　 拉伸應(yīng)力加載可以平行或者垂直于神經(jīng)長軸施加于神經(jīng)，引起相應(yīng)的縱向或者橫向的壓力。由縱向拉伸應(yīng)力引起的神經(jīng)長度改變叫做拉伸形變(strain)，以延長的百分?jǐn)?shù)來表示。神經(jīng)在拉伸的

8、過程中，橫截面積減小。有理論模型研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)神經(jīng)處于拉伸應(yīng)力情況下，神經(jīng)外面包裹的結(jié)締組織管或結(jié)締組織鞘對神經(jīng)的生物力學(xué)特性有十分重要的影響。結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)改變能夠影響神經(jīng)的順應(yīng)性。影響神經(jīng)順應(yīng)性的因素有很多，比如神經(jīng)束的數(shù)量，束膜外結(jié)締組織的橫截面積等等。另外，拉伸速度、拉伸力維持的時間以及重復(fù)拉伸都能改變神經(jīng)的順應(yīng)性。
　　 全身的非特異性結(jié)締組織與神經(jīng)緊密聯(lián)系，相互影響，組成了一個遍布全身的“信息網(wǎng)絡(luò)”，對機(jī)體全身功能活動

9、進(jìn)行調(diào)控。而巨噬細(xì)胞也是筋膜結(jié)締組織中的重要細(xì)胞成分，且在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。本實驗室既往也對巨噬細(xì)胞與雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行了相關(guān)研究，但都是在靜態(tài)培養(yǎng)條件下進(jìn)行的實驗。本課題組前期研究也表明，拉伸刺激能夠使筋膜結(jié)締組織重構(gòu)，并在基因水平對組織細(xì)胞產(chǎn)生影響。此外，有研究表明拉伸應(yīng)力也能影響雪旺細(xì)胞的增殖、基因表達(dá)。然而，拉伸應(yīng)力加載于與巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液共培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞會產(chǎn)生怎樣的影響？這個疑問至今無人解答。本研究，我們采用

10、雪旺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上清液共培養(yǎng)模型，能更好地模擬周圍神經(jīng)受損后的內(nèi)環(huán)境，并采用周期性拉伸應(yīng)力加載，在細(xì)胞增殖和遷移以及基因表達(dá)方面進(jìn)行探索。
　　 目的:
　　 研究腹腔來源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液和周期性拉伸應(yīng)力對RSC96細(xì)胞的影響，為周期性拉伸應(yīng)力干預(yù)周圍神經(jīng)的損傷修復(fù)提供基礎(chǔ)實驗支持。
　　 方法:
　　 1.為獲取巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液，向SD大鼠腹膜腔內(nèi)注射DMEM/F12培養(yǎng)液約10 ml，約10 m

11、in后抽出腹膜腔細(xì)胞懸液，離心后接種于培養(yǎng)板，用差速貼壁法獲得腹腔來源的巨噬細(xì)胞。采用CD68和CD11b對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞鑒定。每隔8小時收集其培養(yǎng)上清液，儲存以供共培養(yǎng)使用。
　　 2.將RSC96大鼠雪旺細(xì)胞均勻接種在六孔拉伸培養(yǎng)板上，分為四組:A組:RSC96（對照組），B組:共培養(yǎng)組，C組:拉伸組，D組:拉伸共培養(yǎng)組。共培養(yǎng)指RSC96雪旺細(xì)胞株與巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液共培養(yǎng)。拉伸即周期性拉伸應(yīng)力加載。

12、r>　　 周期性拉伸應(yīng)力加載采用Flexcell FX-5000 Tension System應(yīng)力加載系統(tǒng)。本次實驗使用圓柱形應(yīng)力加載平臺，提供雙軸向應(yīng)力，由系統(tǒng)自帶的電腦軟件對應(yīng)力進(jìn)行參數(shù)控制。具體設(shè)置為:正弦波，025Hz，最大拉伸形變?yōu)?％，每次持續(xù)時間1小時，每隔12小時拉伸一次。拉伸組一共拉伸處理5次。
　　 3.于第3天收集各組細(xì)胞，采用MTT法檢測每組細(xì)胞的增殖情況。應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測570 nm處各孔的吸光

13、值進(jìn)行統(tǒng)計分析。用劃痕實驗進(jìn)行每組細(xì)胞遷移能力測試，在處理前、后分別使用相差顯微鏡隨機(jī)視野拍照，用ImageJ軟件進(jìn)行結(jié)果分析。
　　 4.用Trizol法提取總RNA，進(jìn)行qPCR實驗檢測每組細(xì)胞所含NGF和Laminin的mRNA含量。
　　 5.用Western Blot法檢測每組細(xì)胞所含NGF和Laminin蛋白的表達(dá)情況，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。
　　 6.重復(fù)三次實驗所得結(jié)果應(yīng)用SPSS13

14、.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，對所測得的結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，組間比較則用LSD檢驗，方差不齊選用Dunnett's T3檢驗。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05認(rèn)為有顯著差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.流式細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示，表達(dá)CD68和CD11b的細(xì)胞占90％，達(dá)到滿意的陽性率。說明這種方法是獲得腹腔巨噬細(xì)胞的簡便可靠方法。
　　 2.四組細(xì)胞于第3天進(jìn)行MTT檢測，

15、細(xì)胞增殖結(jié)果顯示拉伸共培養(yǎng)組最高，拉伸組＞共培養(yǎng)組＞對照組。經(jīng)SPSS13.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析，顯示組間比較有顯著差異（F=28.833，P=0.000）。后續(xù)LSD檢驗發(fā)現(xiàn)處理組與對照組相比，均具有顯著差異(P值分別為0.034，0.000，0.000)。說明腹腔來源的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液與RSC96雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)，以及5％的拉伸形變的周期性拉伸應(yīng)力加載對RSC96雪旺細(xì)胞都具有明顯的促進(jìn)增殖的作用。處理組進(jìn)行兩兩

16、比較，B、C兩組間C組高于B組，具有顯著差異(P=0.009)。這說明在5％的拉伸形變的周期性拉伸應(yīng)力對RSC96雪旺細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用要優(yōu)于共培養(yǎng)。B組和D組比較，D組高于B組，有顯著差異(P=0.000)。同樣說明，在腹腔巨噬細(xì)胞上清液共培養(yǎng)條件下，周期性拉伸應(yīng)力加載能明顯促進(jìn)RSC96雪旺細(xì)胞的增殖。而C、D兩組比較發(fā)現(xiàn)，D組高于C組，具有顯著差異（P=0.026），說明同樣在周期性拉伸應(yīng)力加載條件下，共培養(yǎng)組增殖比單純應(yīng)力加載要

17、明顯。這兩個結(jié)果也證明，周期性拉伸應(yīng)力的加載和腹腔巨噬細(xì)胞上清液共培養(yǎng)對于RSC96雪旺細(xì)胞的增殖，兩者可能具有協(xié)同效應(yīng)。
　　 3.為了測試不同處理組的細(xì)胞遷移情況，我們進(jìn)行了劃痕實驗。經(jīng)過3天不同的處理之后，四組與處理前相比，空白面積顯著減少（P=0.000）。B、C、D組空白區(qū)域面積值與A組相比，均顯著減少(P=0.000)，說明細(xì)胞遷移明顯增強(qiáng)。One-way ANOVA進(jìn)行組間比較，顯示有顯著差異(F=571.670，

18、P=0.000)。進(jìn)一步進(jìn)行LSD檢驗分析發(fā)現(xiàn)，除了處理后的B、C兩組之間相比，P=0.063(P＞0.05)外，其余兩兩比較均有顯著差異（P=0.000）。說明巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)和周期性拉伸應(yīng)力加載都對RSC96雪旺細(xì)胞的遷移具有促進(jìn)作用，但其效應(yīng)可能沒有明顯的差別。然而D組與B、C兩組比較均有顯著差異(P=0.000)，D組高于B、C兩組，說明這兩種處理條件對雪旺細(xì)胞的遷移可能具有協(xié)同促進(jìn)作用。
　　 4.經(jīng)過3天不同的處理，分

19、別用qPCR和Western blot法檢測每組所含NGF的mRNA和蛋白表達(dá)。qPCR結(jié)果表明各組均比A組高，并具有顯著性差異(P值分別為0.002,0.006，0.002)。同時，B、C、D三組NGF蛋白表達(dá)相比，均比A組高，也具有顯著差異（P=0.000）。說明腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液和周期性拉伸應(yīng)力加載都能顯著提高NGF mRNA和蛋白的表達(dá)水平。qPCR結(jié)果顯示B組和C、D組之間沒有顯著性差異，P值分別為0.463和0.948。

20、C組和D組之間也沒有顯著差異，P=0.502。Western blot檢測則發(fā)現(xiàn)B、C、D三組之間NGF蛋白表達(dá)有顯著差異(P=0.000)，D組表達(dá)最高，C組高于B組，說明周期拉伸應(yīng)力加載促進(jìn)NGF蛋白的表達(dá)效應(yīng)可能要優(yōu)于共培養(yǎng)，這兩種處理因素對RSC96細(xì)胞的NGF蛋白表達(dá)可能具有協(xié)同促進(jìn)作用。
　　 5.經(jīng)過3天不同的處理，分別用qPCR和Western blot法檢測每組所含Laminin的mRNA和蛋白表達(dá)。qPCR結(jié)

21、果顯示B、C、D三組細(xì)胞Laminin的mRNA表達(dá)與A組相比，均比A組表達(dá)高，并具有顯著差異(P值分別為0.003，0.005,0.000)。B、C兩組之間比較P=0.736，兩者沒有顯著性差異。而D組分別和B、C兩組相比，有顯著差異，P值分別為0.049，0.028。Western blot結(jié)果用LSD法進(jìn)行各組間比較，均有顯著性差異(P=0.000)。說明巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液和周期性拉伸應(yīng)力加載條件下，均能明顯促進(jìn)雪旺細(xì)胞Lamin

22、in的表達(dá)。巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)和周期性拉伸應(yīng)力對雪旺細(xì)胞Laminin表達(dá)可能具有協(xié)同促進(jìn)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.腹腔來源的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液與RSC96雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)，能明顯促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖和遷移，并能明顯促進(jìn)雪旺細(xì)胞表達(dá)NGF和Laminin。
　　 2.周期性拉伸應(yīng)力加載于RSC96雪旺細(xì)胞，能能明顯促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖和遷移，并能明顯促進(jìn)雪旺細(xì)胞表達(dá)NGF和Laminin。
　　 3.巨噬細(xì)胞培養(yǎng)