淫羊藿苷促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和表型維持及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分淫羊藿苷促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和表型維持
　　目的：證明淫羊藿苷具有促進(jìn)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和表型維持的作用。
　　方法：用CCK8法和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定淫羊藿苷對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖的影響；用RT-qPCR、Western Blot、免疫熒光的方法檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)增殖基因（PCNA、Ki67和CyclinD1）表達(dá)的影響；用RT-qPCR檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)軟骨特征基因（SOX9、COL2和Aggrecan）表達(dá)的影響。
　　

2、結(jié)果：在淫羊藿苷作用下，細(xì)胞增殖能力得到加強(qiáng)，并且PCNA、Ki67、CyclinD1、SOX9、COL2和Aggrecan的表達(dá)增加。
　　結(jié)論：淫羊藿苷能有效促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖，并通過上調(diào)SOX9、COL2和Aggrecan的表達(dá)來維持關(guān)節(jié)軟骨表型。
　　第二部分YAP在淫羊藿苷促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖中的作用
　　目的：研究YAP蛋白在淫羊藿苷促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖中的作用。
　　方法：通過RT-qPCR和We

3、stern Blot的方法檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)YAP及其目的基因Ankrd1和CTGF表達(dá)的影響；用shRNA沉默YAP，通過RT-qPCR和Western Blot的方法檢測(cè)Ankrd1、CTGF、PCNA、Ki67和CyclinD1的表達(dá)情況，以及沉默YAP后再用淫羊藿苷干預(yù)時(shí)，上述基因的表達(dá)情況。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，用免疫組化的方法檢測(cè)口服淫羊藿苷（每天2mg持續(xù)30天）對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨中YAP和CTGF表達(dá)的影響；
　　結(jié)果：在體外實(shí)驗(yàn)

4、中，淫羊藿苷能促進(jìn)YAP、Ankrd1和CTGF的表達(dá)；YAP沉默后，Ankrd1、CTGF、PCNA、Ki67和 CyclinD1的表達(dá)下調(diào)，此時(shí)淫羊藿苷不再促進(jìn)這些基因的表達(dá)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，淫羊藿苷可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨中YAP和CTGF的表達(dá)。
　　結(jié)論：淫羊藿苷通過YAP促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖，通過口服淫羊藿苷可以在關(guān)節(jié)軟骨局部產(chǎn)生有效的藥物濃度。
　　第三部分淫羊藿苷影響YAP磷酸化修飾的分子機(jī)制
　　目的：研究淫羊藿

5、苷影響YAP磷酸化修飾的分子機(jī)制以及F-actin與Hippo通路調(diào)控YAP活性時(shí)的相互關(guān)系。
　　方法：淫羊藿苷作用細(xì)胞后，用Western Blot方法檢測(cè)p-YAP、p-MYPT和p-Cofilin的水平以及用免疫熒光方法檢測(cè)YAP蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位情況，來觀察YAP蛋白和ROCK通路的活性狀態(tài)。用拉春庫林B作用細(xì)胞1小時(shí)以及先用淫羊藿苷預(yù)處理3天再用拉春庫林B作用細(xì)胞1小時(shí)，通過Western Blot方法檢測(cè)p-YAP的水

6、平以及通過免疫熒光的方法來觀察 F-actin的形態(tài)，以判斷 F-acin是否為淫羊藿苷影響YAP蛋白磷酸化修飾的唯一靶點(diǎn)；通過等重同位素多標(biāo)簽相對(duì)定量（iTRAQ）蛋白質(zhì)組學(xué)來尋找淫羊藿苷影響YAP磷酸化修飾的新機(jī)制。
　　結(jié)果：淫羊藿苷抑制YAP蛋白磷酸化并促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞核；促進(jìn)MYPT和Cofilin蛋白磷酸化；雖不能阻止拉春庫林B解聚F-action但它能抑制F-actin解聚后引起的YAP蛋白磷酸化。此外，它還能降低SA