PSMAe-p驅(qū)動shRNA阻斷PCA-1表達對前列腺癌細胞作用的研究.pdf

1、第一部分靶向干擾PCA-1的shRNA質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建與鑒定
　　 目的:
　　 成功構(gòu)建前列腺特異膜抗原增強子/啟動子(PSMAe/p)調(diào)控的靶向的shRNA重組質(zhì)粒PSMAe/p-shPCA-1。
　　 方法:人工合成針對PCA-1基因的shRNA對應(yīng)模版的DNA序列,將此序列定向克隆到含有BamH I、EcoR I雙酶切位點載體質(zhì)粒pSIREN-RetroQ-ZsGreen,然后再連接到含有Sal I、B

2、am H I雙酶切位點PSMA增強子/啟動子的質(zhì)粒載體(PSMAe/p)上。重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序進行鑒定;
　　 結(jié)果:
　　 通過PCR,質(zhì)粒雙酶切電泳和靶向序列測序鑒定,人工合成的靶向干擾片段成功插入載體PSMAe/p上,重組質(zhì)粒載體雙酶切圖譜和靶向序列檢測結(jié)果符合預(yù)期結(jié)果。
　　 結(jié)論:
　　 成功構(gòu)建以前列腺特異性膜抗原增強子/啟動子驅(qū)動的靶向干擾PCA-1的shRNA質(zhì)粒

3、表達載體PSMAe/p-shPCA-1。
　　 第二部分 PSMAe/p驅(qū)動shRNA靶向PCA-1抑制PCa細胞實驗研究
　　 目的:觀察人前列腺癌抗原-1基因沉默后對不同前列腺癌細胞系的影響,探索人前列腺癌抗原-1基因與前列腺癌進展、惡性增殖、轉(zhuǎn)移浸潤能力的關(guān)系。
　　 方法:
　　 首先用免疫組化方法檢測人前列腺癌細胞系LNCaP和PC-3中PCA-1表達:通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2

4、000介導重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人前列腺癌細胞系LNCaP和PC-3細胞中。應(yīng)用細胞劃痕實驗觀察轉(zhuǎn)染細胞的遷移能力變化,MTT法檢測干擾后細胞體外增殖情況,同時通過Transwell細胞浸潤實驗檢測干擾后細胞轉(zhuǎn)移浸潤能力;應(yīng)用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)PCA-1的變化。
　　 結(jié)果:
　　 人前列腺癌細胞系LNCaP和PC-3中均有PCA-1蛋白表達;干擾后LNCaP細胞的遷移能力明顯下降,體外增殖速率明顯下調(diào),浸潤能力顯著減弱。