前列腺干細胞抗原(PSCA)對前列腺癌細胞周期的調控及其機制研究.pdf

1、【研究背景】
　　前列腺干細胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）基因編碼一個由123個氨基酸組成的糖蛋白，與SCA-2一樣，均屬于細胞表面葡萄糖磷酯酰肌醇（glycosyl phosphatidylinositol,GPI）錨定抗原（Thy-1/Ly-6基因）家族成員。目前相關研究表明PSCA具有很高的前列腺癌組織特異性，并且在局部進展性前列腺癌組織以及前列腺癌骨轉移灶中高表達，提示PSCA可能

2、在前列腺癌進展中起重要作用。然而，其具體生物學機制仍不清楚。
　　【目的】
　　研究PSCA在前列腺癌細胞增殖中的作用，并初步探討其對周期凋亡的調控機制。
　　【材料和方法】
　　前期已成功構建的穩(wěn)定沉默PSCA的DU145細胞株及穩(wěn)定過表達PSCA的LNCAP細胞株。30只小鼠隨機分為6組，每組5只：DU145，DU145-NC(穩(wěn)定轉染無關序列的DU145細胞），DU145 shRNA（穩(wěn)定沉默PSCA的DU

3、145細胞）、LNCAP，LNCAP- vector（穩(wěn)定轉染空載體的的LNCAP細胞），LNCAP PSCA（穩(wěn)定過表達PSCA的LNCAP細胞）。通過MTS、平板克隆形成實驗等體外功能實驗以及動物移植瘤實驗研究PSCA對前列腺癌細胞增殖的影響；通過流式細胞術了解細胞周期凋亡的變化，PCR、Weston blot等實驗檢測細胞周期凋亡相關基因表達；免疫組化染色研究組織PSCA以及c-myc等周期相關基因的表達；使用c-myc-siRN

4、A對過表達PSCA的LNCAP進行轉染，進一步研究PCSA對c-myc的調控作用；收集2013年12月前在我院前列腺癌初治病例。該研究納入的所有病例均行前列腺穿刺活檢或手術后的病理檢查確診為前列腺腺癌，并且相關檢查未見遠處轉移；納入患者的病理組織收集前均未接受化學治療或者放療；病例資料中如缺失隨訪資料、術前PSA值、Gleason評分、手術切緣情況或淋巴結是否轉移等描述均予以排除。通過病歷查找、電話隨訪對患者年齡、血清PSA、Gleas

5、on評分、腫瘤臨床分級、生化復發(fā)、總體生存等資料進行采集。
　　【結果】
　　MTS結果顯示：與對照組相比，72小時后，DU145-shRNA細胞增殖能力明顯較對照組減弱(P=0.000)；而過表達PSCA的LNCAP細胞增殖能力在48小時后明顯較對照組增強(P=0.000)。平板克隆實驗：DU145細胞在平板實驗中第7天便有較多的肉眼可見的克隆，于第七天終止實驗，進行后續(xù)的染色；而LNCAP細胞則需到14天才出現(xiàn)較多的肉眼

6、可見的克隆，于第14天終止實驗，進行后續(xù)的染色。結果顯示，在沉默PSCA的表達后，DU145 shRNA與對照組相比，形成的克隆更少、更小(P=0.000)；同樣的，過表達PSCA后的LNCAP與對照組相比，LNCAP PSCA的克隆數(shù)目明顯增多(P=0.000)。動物體內移植瘤實驗結果：與體外細胞功能實驗結果相一致，PSCA明顯加速了移植瘤在裸鼠體內的生長速度：DU145shRNA組在接種第19天后移植瘤體積開始明顯小于對照組（P=0

7、.000）；過表達PSCA后，LNCAP-PSCA組在接種2周后體積明顯比對照組增大；4周后對移植瘤進行解剖稱重，肉眼所見，DU145 shRNA與LCAP-vector移植瘤大體觀上較對照組?。籇U145 shRNA瘤重明顯較對照組減小，而LNCAP-PSCA瘤重明顯較對照組增加(P=0.0000)。流式細胞術：，在正常DU145組G0/G1期細胞(48.56％±2.0%)明顯增加至DU145shRNA組（60.32%±1.2%,P=

8、0.000),DU145 NC組G0/G1期細胞為49.47%±2.5%，與正常組比較差異（P=0.492）；DU145-shRNA組凋亡率4.87%±0.48%，DU145-NC組凋亡率4.70%±0.61%，DU145組凋亡率4.23%±0.53%，經(jīng)比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.494）;LNCAP-PSCA組凋亡率1.89%±0.37%，LNCAP-vector組凋亡率2.26%±0.13%，LNCAP正常組凋亡率2.56%±0

9、.18%，經(jīng)比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.124）。qRT-PCR以及weston blot結果顯示：與DU145-NC組比較，DU145shRNA組無論在mRNA水平或者蛋白水平，c-myc、cyclin D1、cyclin E2表達下調P=0.000)；與之相反，在過表PSCA的LNCAP組中c-myc、cyclin D1、cyclin E2表達上調(P=0.000)。與周期抑制相關的基因P16、P27、凋亡相關蛋白caspase3

10、并沒有明顯差異。免疫組織化學法染色顯示，動物移植瘤組織DU145siRNA組組織表達PSCA、c-myc、cyclin D1、cyclin E2下調；LNCAP-PSCA組表達PSCA、c-myc、cyclin D1、cyclin E2上調，細胞PCR、western blot結果相符。對LNCAP-PSCA轉染干擾質粒si-c-myc后，c-myc、cyclin D1、cyclin E2表達下降（P=0.00），MTS實驗顯示si-c

11、myc+PSCA組生長曲較對照組線明顯減慢(P=0.000）。進一步對調控c-myc上游通路檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，P-AKT在DU145 shRNA蛋白水平明顯降低(P=0.000)，而在LNCAP-PSCA中明顯提高(P=0.000)。p-ERK1/2在DU145siRNA(p=0.886)以及LNCAP-PSCA（P=0.439）無明顯變化。使用AKT抑制劑MK2206后，c-myc以及其下游cyclin D1、cyclin E2

12、表達明顯下調(P=0.000)。MTS實驗MK2206明顯減緩過表達PSCA的LNCAP的生長曲線。通過查找病歷、電話訪問等收集到資料完整的前列腺癌病例78例，入院時間在2008年2月到2013年12月之間，結果顯示，高表達PSCA與高表達c-myc相關（P=0.014）；高表達PSCA和高表達c-myc都分別與gleason評分、BCR以及OS相關（P＜0.05），與年齡、血清PSA水平不相關（P＞0.05）；Kaplan–Meier

13、生存曲線顯示高表達PSCA與高表達c-myc與前列腺癌預后不良相關（P＜0.05）；通過cox多因素回歸分析表明PSCA和c-myc可作為獨立預測前列腺癌生化復發(fā)（分別為：HR2.834,95%CI1.124-7.141,P=0.027 and HR3.232,95%CI1.366-7.649,P=0.008）以及總體生存率（分別為HR10.559,95% CI1.295-86.129,P=0.028 and HR12.703,95%

14、CI1.611-100.183,P=0.016,respectively)的危險因素。
　　【結論】
　　PSCA通過激活PI3K/AKT通路上調c-myc以及其下游cyclin D1、cyclin E2基因的表達，促進細胞周期由G0/G1期進入S期，從而促進前列腺癌細胞的增殖；而PSCA沉默可誘導細胞周期G0/G1期阻滯。臨床上高表達PSCA與高表達c-myc相關，并且與前列腺癌患者更高的生化復發(fā)率以及更短的照片那個題生存