人肺腺癌細胞耐順鉑機制的蛋白質組學研究.pdf

1、研究背景： 肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，WHO的資料顯示，肺癌將成為21世紀對人類威脅最大的腫瘤。肺癌的治療是一種多學科的綜合治療，其中化療為治療的重要手段之一。但目前對晚期NSCLC病人化療的有效率僅為30-40％，其五年生存率小于15％。肺癌的耐藥性是造成化療失敗的重要原因。研究腫瘤細胞的耐藥產生機制已成為國內外科學工作者的重要課題。系統地研究腫瘤耐藥機制比較復雜，往往是多因素參與、多種機制同時存在的事件，而且不同機制間常相

2、互影響。目前發(fā)現p170糖蛋白質、多藥耐藥相關蛋白質、肺耐藥蛋白質、乳腺癌耐藥相關蛋白質、拓撲異構酶Ⅱ和谷胱甘肽S轉移酶等多藥耐藥相關蛋白質與腫瘤多藥耐藥性相關。發(fā)現的與耐藥有關的機制可歸納為以下幾個方面：細胞膜或胞漿與胞核之間藥物攝入和外流的改變使細胞內藥物濃度降低；在細胞質和細胞器水平的藥物亞細胞分布的改變，使藥物無法接近其作用靶點；細胞內藥物靶酶水平改變或細胞內酶與藥物親和力改變而導致的耐藥；腫瘤細胞解毒功能和修復功能增強，促使藥

3、物代謝加強而導致的耐藥；細胞代謝的變化和腫瘤細胞抗凋亡能力增強等。雖然已有的研究揭示了一些腫瘤的耐藥機制，但目前仍然不能完全解釋腫瘤耐藥現象并有效逆轉腫瘤細胞的耐藥。蛋白質組學是動態(tài)研究一個細胞、組織或有機體中所表達的全部蛋白質的新興學科，利用蛋白質組學研究的高通量特點，有可能發(fā)現新的耐藥相關蛋白，為解釋耐藥機制和有效逆轉腫瘤細胞耐藥提供線索。為此，本研究以人肺腺癌細胞株A549和耐順鉑細胞株A549/CDDP為研究對象，采用蛋白質組學

4、的技術和方法研究肺癌耐藥的分子機制。 第一章人肺腺癌A549及A549/CDDP細胞株蛋白質組學分析 目的：建立A549及A549/CDDP細胞株總蛋白的雙向凝膠電泳圖譜(2-DE)，分析辨別兩組間的差異表達蛋白質點。方法：1.常規(guī)培養(yǎng)A549及A549/CDDP細胞，用四氮唑藍比色法(MTT)檢測A549/CDDP細胞耐藥指數(RI)。2.采用一步抽提法制備A549及A549/CDDP細胞株的總蛋白質，應用雙向凝膠電泳

5、技術建立凝膠電泳圖譜，膠體考馬斯亮藍染色，Image Scanner掃描儀掃描凝膠。3.PDQuest軟件對兩株細胞蛋白質的雙向電泳圖譜進行比較分析。結果：1.A549/CDDP對順鉑的耐藥指數為7.8。 2.獲得了分辨率高和重復性好的A549、A549/CDDP細胞總蛋白的2-DE圖譜，兩組間有15個差異表達的蛋白質點，在A549/CDDP組有8個表達上調，7個表達下調。結論1.人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/CDDP耐藥性較好。2.獲

6、得了分辨率高和重復性好的A549、A549/CDDP細胞總蛋白的2-DE圖譜。為下一步的實驗奠定了基礎。 第二章 A549、A549/CDDP細胞株差異蛋白的鑒定與驗證 目的：鑒定與驗證A549、A549/CDDP細胞株差異表達蛋白質，尋找肺癌順鉑耐藥的相關蛋白質。方法：采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)對差異表達的蛋白質進行分析，獲取MALDI-TOF-MS肽質量指紋圖譜(PMF)，用Ma

7、scot軟件查詢NCBInr和SWISS-PROT、數據庫搜索鑒定差異蛋白。并應用細胞免疫化學和R17-PCR驗證部分鑒定的蛋白質。結果：初步鑒定了13個差異表達蛋白質，多數與腫瘤的生長、浸潤、代謝、免疫等相關。這些蛋白質按功能主要可以分為五類，即代謝相關酶，細胞結構相關蛋白質，分子伴侶，與解毒和DAN修復相關蛋白質，以及信號傳導相關蛋白質。免疫細胞化學和RT-PCR也顯示了丙酮酸激酶M2(Pyruvate kinase M2，PKM2

8、)、細胞角蛋白18(Cytoskeletal 18，CK18)在兩組間存在表達差異。結論：1.經質譜分析及生物信息學檢索在A549、A549/CDDP細胞株2-DE圖譜中表達差異的蛋白質斑點，初步鑒定出13種蛋白質，提示這些蛋白可能與肺腺癌細胞耐藥株耐藥相關。2.用細胞免疫化學和RT-PCR法對CK18，PKM2進行進一步驗證，結果與蛋白質組學一致，說明采用蛋白質組學篩選出來的差異蛋白在A549、A549/CDDP中確實存在，可作為候選

9、的肺癌耐藥相關蛋白，并可進一步進行蛋白質功能的研究。 第三章　SiRNA-PKM2封閉PKM2基因表達與肺癌順鉑耐藥的相關性研究 目的：應用載體介導的RNAi干擾技術抑制PKM2在A549細胞株中的表達，分析PKM2與肺腺癌順鉑耐藥的關系，初步探討PKM2的功能。方法：培養(yǎng)A549細胞，設計SiRNA-PKM2，通過陽離子脂質體轉染至細胞內。實驗分：對照組、空白載體組、SiRNA-neg組、SiRNA-PKM21組、Si

10、RNA-PKM22組。1.分別用免疫細胞化學方法和RT-PCR方法檢測SiRNA-PKM2對A549細胞中PKM2表達的影響。2.用SiRNA-PKM2封閉A549細胞后，應用四氮唑藍比色法(MTT)檢測其耐藥性的變化。結果：1.免疫細胞化學結果顯示：SiRNA-PKM21組、SiRNA-PKM22組PKM2的陽性系數與對照組比較，差異有顯著性(P＜0.05)，而對照組、空白載體組、SiRNA-neg組之問比較，無顯著性差異(P>0.0

11、5)，SiRNA-PKM21組和SiRNA-PKM22組之間比較有顯著性差異。RT-PCR方法檢測各組細胞PKM2mRNA的表達，SiRNA-PKM21組、SiRNA-PKM22組PKM2mRNA的相對表達強度依次為0.3350±0.0370，0.6750±0.0940與對照組、空白載體組、SiRNA-neg組比較，差異有顯著性(P＜0.05)，而對照組、空白載體組、SiRNA-neg組之間比較，無顯著性差異(P＞0.05)，SiRNA