ADAM10促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞順鉑化療耐藥.pdf

1、目的：
　　迄今為止，癌癥仍然是世界性難題，如今雖然在癌癥的治療方面已取得很大進(jìn)步，特別是對(duì)肺癌的治療，但那些伴有侵略性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的預(yù)后仍然不良。晚期NSCLC的治療主要依靠以鉑劑為主的雙重化療，遺憾的是其只有20％的應(yīng)答率。對(duì)化療反應(yīng)不佳多是因?yàn)榘┘?xì)胞的多藥耐藥性(MDR)，尤其是對(duì)于順鉑的耐藥。因此，攻克化療耐藥問題迫在眉睫。
　　解聚素及金屬蛋白酶10，亦稱ADAM10或CDw156或CD156c，在人

2、類中是由ADAM10基因所編碼的蛋白質(zhì)。ADAM10經(jīng)由Notch1信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的遷移和侵襲。ADAM10在膀胱癌細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲，提高細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐性。那么在NSCLC中ADAM10是否與順鉑化療耐藥有關(guān)呢？
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)與si RNA干擾
　　本實(shí)驗(yàn)頻繁采用的A549、A549/DDP、H1299細(xì)胞系均用RPMI1640液體培養(yǎng)基，在實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。A

3、DAM10 siRNA(h)和control siRNA購自Santa。將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)長滿的細(xì)胞重新鋪于6孔板中，次日采用lipo3000試劑進(jìn)行干擾，6小時(shí)后換液繼續(xù)培養(yǎng)，兩天后免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的基因蛋白含量。
　　2、細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)
　　將狀態(tài)良好且已經(jīng)長滿的細(xì)胞計(jì)數(shù)，重新置于96孔板中（4000/孔），待細(xì)胞貼壁且狀態(tài)穩(wěn)定后加入梯度濃度的順鉑，設(shè)五個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)組，48h后避光每孔加入MTT溶液，4h后加入DMSO，搖勻使

4、其充分溶解，最后Model550酶標(biāo)儀測(cè)定每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組的OD值，數(shù)據(jù)處理時(shí)舍棄兩個(gè)離均的OD值，剩余的三個(gè)OD值用于計(jì)算結(jié)果。
　　3、Western Blot
　　將六孔板中長滿且狀態(tài)佳的細(xì)胞收集，在冰上操作，加入預(yù)冷的裂解液30分鐘后，離心，保留上清液。配制蛋白樣，設(shè)置上樣量為60μ g。電泳分離后，將膠質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)印完畢用專用封閉液封閉2h，4℃冰箱里一抗孵育，第二天將其分別與對(duì)應(yīng)的二抗孵育2h，ECL顯色

5、，最后采集結(jié)果。
　　4、提取RNA及Real-time RT-PCR
　　ADAM10 siRNA干擾組與對(duì)照組分別用PBS清洗1次，RNASio plus裂解細(xì)胞，加入氯仿，離心，取上清，加入異丙醇，高速低溫離心，保留沉淀，再加入乙醇（濃度為75％），高速低溫離心，棄乙醇，RNase-free水溶解沉淀物。測(cè)濃度，使3μ l液體中含有1800ng RNA。Real-time RT-PCR在7900實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)中完成

6、。
　　ADAM10，forward5'GAGGAGTGTACGTGTGCCAGTT-3'reverse5'GACCCCTGAAGTGCCTACTCCA-3'
　　5、流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
　　采用AnnexinⅤ/PI試劑檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，順鉑處理細(xì)胞48h，Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入Annexin-Ⅴ-FITC，再移至避光環(huán)境下加入碘化丙錠PI（最終濃度為1μg/ml）移液槍吹打混勻，1小時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)

7、結(jié)果檢測(cè)。
　　6、免疫熒光實(shí)驗(yàn)
　　24孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，24h后用4％多聚甲醛固定細(xì)胞，再用5％BSA封閉細(xì)胞1小時(shí)，ADAM10抗體孵育，置于水浴盒中，儲(chǔ)存于4℃冰箱，第二天二抗避光孵育，2h后DAPI染核，避光環(huán)境下40％的甘油封片。倒置顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　7、統(tǒng)計(jì)方法
　　采用GraphPad Prism5統(tǒng)計(jì)分析軟件，通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05