人結腸上皮衰老機制的蛋白質組學研究.pdf

1、人類的結腸具有吸收和分泌的重要機能，參與機體對水、電解質平衡的調節(jié)，維持內環(huán)境穩(wěn)定。結腸的上皮細胞是致病因子與外環(huán)境作用于機體的主要靶細胞之一，也是機體許多病理變化的始發(fā)環(huán)節(jié)及主要病灶所在。衰老(aging)通常被定義為機體的正常生理功能隨著年齡的增長而緩慢減退的過程，它是一種正常的、復雜的、不可逆的生物學過程，是機體的功能發(fā)生衰退及生理功能紊亂的綜合表現。結腸上皮同樣會隨著年齡的增長而出現生理功能逐漸減退，同時惡性腫瘤等多種腸道疾病的

2、發(fā)病率明顯升高。針對結腸上皮的衰老機制，國內外也已開展了許多相關的研究：Lopes等人觀察到衰老大鼠的結腸平滑肌細胞線粒體的形態(tài)和功能都發(fā)生了改變；Ono等人發(fā)現，隨著年齡的增加，消化道上皮的DNA突變頻率增加，而以結腸的突變頻率最高；Tsurudome等發(fā)現，在老年人的結腸癌組織中8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-hydroxydeoxyguanosine)的水平升高，提示氧自由基對結腸上皮細胞DNA的損傷程度增加。 以往的這些研究雖然

3、揭示了一些結腸上皮衰老以及衰老結腸上皮對癌癥易感的機理，但是這些研究多數是從某個或某幾個基因出發(fā)，而結腸上皮的衰老是一個漸進的、多基因、多因素參與的復雜過程。另外，以往研究多集中在DNA和RNA水平，但由于基因轉錄和翻譯水平的復雜性，DNA和RNA水平的變化并不能完全反映蛋白質水平的變化，而蛋白質是生理功能的執(zhí)行分子，并且蛋白質的翻譯后修飾狀況、蛋白質的相互作用、蛋白質的動態(tài)變化等信息僅通過基因組研究是無法獲知的。傳統的對單個蛋白質的研

4、究方式和研究技術已無法滿足后基因組時代里對衰老這類復雜生命現象的研究要求，而以細胞內全部蛋白質為研究對象的蛋白質組學的出現則為衰老研究提供了新的研究思路和技術。差異表達蛋白質組學是蛋白質組學研究的一個重要研究內容，與試圖了解細胞內所有的表達蛋白質一“表達蛋白質組學”不同的是，差異表達蛋白質組學研究更多的是關注于細胞在不同生理、病理狀態(tài)下的差異表達蛋白質，以期尋找或發(fā)現不同生理或病理狀態(tài)下的特征性蛋白質。為此，本研究以青年人和老年人的正常

5、結腸粘膜上皮組織為研究對象，采用比較蛋白質組學技術和方法來研究人類結腸上皮衰老相關的蛋白質，為闡明結腸上皮衰老的分子機制提供有意義的線索。首先抽提制備青年組和老年組的結腸粘膜上皮組織的總蛋白質，再應用雙向凝膠電泳技術建立了重復性和分辨率均較好的青年組和老年組結腸粘膜上皮組織總蛋白質的雙向凝膠電泳圖譜。經銀染顯色，ImageScanner掃描儀掃描凝膠,PDQuest圖像分析軟件對兩組的組織總蛋白質的雙向電泳圖譜進行了比較，識別兩組差異表

6、達的蛋白質點47個，再聯合采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧串聯質譜(ESI-Q-TOF-MS)對差異表達的蛋白質進行分析，獲取MALDI-TOF-MS肽質量指紋圖譜及ESI-Q-TOF肽序列標簽，再經Mascot軟件搜索SWISS-PROT蛋白質數據庫鑒定了其中的38個差異表達的蛋白質。 為了驗證比較蛋白質組學研究結果，采用Real-time quantitativeRT-PCR和West

7、ern blot分析以及免疫組織化學技術對部分差異表達蛋白質在青年組和老年組結腸粘膜上皮組織中的表達水平進行了檢測，其結果與比較蛋白質組學研究的結果一致。 為了進一步驗證比較蛋白質組學篩選到的差異蛋白質是否為真正的與衰老相關的差異蛋白質，本文采用D-半乳糖誘導方法建立NIH/3T3細胞復制性衰老模型，應用Western blot檢測2個差異蛋白質(EF-Tu、Rhodanese)在衰老NIH/3T3細胞中的表達變化，觀察到EF-

8、Tu和Rhodanese在衰老NIH/3T3細胞中的表達水平顯著下調，說明EF-Tu和Rhodanese表達下調可能與體外細胞衰老有關。 本研究在建立青年組和老年組結腸粘膜上皮組織總蛋白質雙向電泳圖譜的基礎上，采用質譜分析結合數據庫搜索共鑒定出38個差異表達蛋白質，這些蛋白質按功能主要可以分為九類，即抗氧化蛋白質、信號傳導類蛋白質、與凋亡相關蛋白質、分子伴侶、與蛋白質折疊相關蛋白質、基本代謝相關的酶類、轉錄與翻譯相關蛋白質、能量