人表皮細(xì)胞整合素β1啟動(dòng)子活性分析的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 目前大面積深度燒傷患者由于自體皮源不足，難于滿足大面積皮膚缺損患者盡早封閉創(chuàng)面的要求，是嚴(yán)重限制燒傷治療水平提高的重要原因之一。隨著發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)等生命科學(xué)的飛速發(fā)展和組織工程、干細(xì)胞工程等技術(shù)的進(jìn)步，表皮干細(xì)胞(keratinocytestemcell，KSC)在燒傷創(chuàng)面修復(fù)中的作用引起了同行們的廣泛關(guān)注。表皮干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力，又可向各個(gè)階段表皮細(xì)胞分化以維持皮膚新陳代謝，因此KSC作為皮膚重建的“

2、種子細(xì)胞”成為研究的熱點(diǎn)⑴。在體外培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的KSC用于研究及移植，在體內(nèi)外誘導(dǎo)KSC快速增殖和定向分化，對(duì)于研究組織工程皮膚和創(chuàng)面愈合的分子機(jī)制具有重要意義，了解KSC增殖與分化的調(diào)控機(jī)制也是進(jìn)一步探討上述問(wèn)題的關(guān)鍵所在。 既往研究表明，整合素β1在KSC增殖與分化中扮演重要角色。在表皮基底層及毛囊隆突部有高水平的整合素β1表達(dá)，而這些部位富含干細(xì)胞，KSC表面的整合素β1的表達(dá)較由KSC分化而來(lái)的快速增殖細(xì)胞(tran

3、sitamplifyingcell，TAC)高2～3倍，KSC主要通過(guò)與基底膜的粘附維持其干細(xì)胞特性，若KSC脫粘附，則不可避免走向終術(shù)分化[2.3]，整合素β1被公認(rèn)為是KSC未分化的分子標(biāo)記之一。Jones等發(fā)現(xiàn)高表達(dá)整合素β1的表皮細(xì)胞具有更高的克隆形成能力，傳代次數(shù)顯著多于低表達(dá)的細(xì)胞⑷；本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)構(gòu)建整合素β1小RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染KSC，發(fā)現(xiàn)下調(diào)表達(dá)整合素β1蛋白，實(shí)驗(yàn)組克隆形成率比對(duì)照組降低，促進(jìn)KSC的分化⑸，這些

4、都提示整合素β1參與KSC的增殖分化的調(diào)控。 PieroC等人用MG-63細(xì)胞株(人骨肉瘤細(xì)胞株)研究證實(shí)整合素β1表達(dá)是由兩個(gè)啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控，缺少CAAT盒和TATA盒，及高GC含量，且作為轉(zhuǎn)錄起始的兩個(gè)獨(dú)立啟動(dòng)子存在，促進(jìn)整合素β1基因表達(dá)，產(chǎn)生兩種mRNA，他們有相同的編碼序列，近端和遠(yuǎn)端啟動(dòng)子在正?；虼碳ひ蛩刈饔孟露寄艽龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄，但具體參與轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子及其機(jī)制尚不清楚⑹。 人表皮細(xì)胞株(Humanadult

5、skinkeratinocytos，HaCaT)來(lái)源于正常成人皮膚，是具有完整的表皮分化能力的永生化細(xì)胞株。研究表明，將HaCaT移植到裸鼠上，HaCaT可以分化形成上皮組織，表達(dá)特異性分化蛋白標(biāo)志⑺；另外，本實(shí)驗(yàn)室前期的研究也表明，整合素β1小干擾RNA載體轉(zhuǎn)染HaCaT能夠抑制整合素β1蛋白的表達(dá)，生長(zhǎng)曲線右移，HaCaT的增殖受到抑制⑻，因此說(shuō)明HaCaT可以為研究人表皮細(xì)胞分化的調(diào)控提供一個(gè)非常理想的模型。 研究目的：

6、 本研究應(yīng)用整合素β1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，以HaCaT細(xì)胞為模型，探討表皮細(xì)胞中整合素β1啟動(dòng)子的活性區(qū)域，為進(jìn)一步研究表皮干細(xì)胞的增殖分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 1.以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的含整合素β1啟動(dòng)子序列的重組pGEM-Teasy載體為模板，用PCR分別擴(kuò)增并克隆整合素β1啟動(dòng)子區(qū)全長(zhǎng)(含近端啟動(dòng)子和遠(yuǎn)端啟動(dòng)子序列)、近端啟動(dòng)子和遠(yuǎn)端啟動(dòng)子序列，經(jīng)測(cè)序正確后分別構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-1

7、756(-1442/+314)、pGL3-261(+54/+314)和pGL3-1442(-1442/-1)，轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，檢測(cè)它們?cè)贖aCaT中的啟動(dòng)活性，并比較整合素β1遠(yuǎn)端與近端啟動(dòng)子在HaCaT中的活性，確定其在HaCaT中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。 2.根據(jù)第一部分研究結(jié)果，確定在啟動(dòng)子中發(fā)揮上調(diào)表達(dá)作用的主要序列區(qū)域，再用Tfsitescan軟件對(duì)該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，根據(jù)分析結(jié)果對(duì)其進(jìn)行切割，構(gòu)建啟動(dòng)

8、子缺失片段熒光素酶報(bào)告基因載體，轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞并檢測(cè)熒光素酶活性，分析遠(yuǎn)端啟動(dòng)子的活性及可能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。 研究結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了整合素β1近端啟動(dòng)子、遠(yuǎn)端及全長(zhǎng)啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-1756(-1442/+314)、pGL3-261(+54/+314)和pGL3-1442(-1442/-1)，經(jīng)酶切鑒定及序列測(cè)定表明，其序列與GenBankDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析序列一致，且插入方向正確

9、；用此三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞都有啟動(dòng)子活性，遠(yuǎn)端啟動(dòng)子活性與全長(zhǎng)啟動(dòng)子活性無(wú)顯著差異，但明顯高于近端啟動(dòng)子活性。 2.成功構(gòu)建了整合素β1遠(yuǎn)端啟動(dòng)子連續(xù)缺失片段熒光素酶報(bào)告基因載體，轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞并檢測(cè)熒光素酶活性，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表明，遠(yuǎn)端啟動(dòng)子系列重組質(zhì)粒pGL3-1442(-1442/-1)、pGL3-602(-602/-1)、pGL3-352(-352/-1)、pGL3-212(-212/-1)、pGL3-270(

10、-602/-232)、pGL3-390(-602/-212)轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞后，都有一定啟動(dòng)活性，pGL3-840(-1442/-603)無(wú)明顯啟動(dòng)活性；pGL3-602(-602/-1)片段啟動(dòng)活性最高，明顯高于pGL3-1442(-1442/-1)啟動(dòng)子活性。 研究結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了整合素β1遠(yuǎn)端和近端啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體。 2.通過(guò)熒光素酶活性的分析，在表皮細(xì)胞中整合素β1基因主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域位

11、于遠(yuǎn)端啟動(dòng)子。 3.成功構(gòu)建了整合素β1遠(yuǎn)端啟動(dòng)子連續(xù)缺失片段熒光素酶報(bào)告基因載體。 4.通過(guò)熒光素酶活性的分析，在表皮細(xì)胞中pGL3-602(-602/-1)啟動(dòng)子片段啟動(dòng)活性最高，而pGL3-352(-352/-1)啟動(dòng)子片段啟動(dòng)活性較低，因此位于其中的-602到-353這個(gè)區(qū)域的250bp是整合素β1遠(yuǎn)端啟動(dòng)子的高轉(zhuǎn)錄活性區(qū)。經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析轉(zhuǎn)錄因子C-Rel可能參與了整合素β1的上調(diào)表達(dá)。 5.整合素