山羊、牛MyoG啟動子序列克隆及其活性分析.pdf

1、肌細(xì)胞生成素(myogenin，MyoG)是生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)基因家族中唯一能在骨骼肌細(xì)胞發(fā)育與生長過程中均可表達(dá)的調(diào)控因子，在肌肉細(xì)胞分化過程中起著中心調(diào)控的作用，它正調(diào)控著骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞向成熟肌細(xì)胞分化的過程，是唯一不可代替的生肌調(diào)節(jié)因子。MyoG基因在復(fù)制、擴(kuò)增、基因激活、轉(zhuǎn)錄、翻譯等多級水平上對肌肉發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。基因轉(zhuǎn)錄的起始階段是機(jī)體生長發(fā)育因子進(jìn)行調(diào)控的開端，而此階段調(diào)控的實(shí)質(zhì)是通過啟動子和上游調(diào)控序列的相互作用，調(diào)控

2、目的基因的表達(dá)。因此克隆MyoG基因的啟動子，探討啟動子區(qū)域的啟動活性，有助于從理論上揭示MyoG基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，同時(shí)也有利于揭示肌肉發(fā)育調(diào)控的相關(guān)機(jī)理，為治療人類相關(guān)疾病以及改良家畜肉質(zhì)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本研究分別克隆了山羊和牛的MyoG啟動子序列，并構(gòu)建了真核表達(dá)載體pDsRed-GoatMyoG和pDsRed-BosMyoG，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染不同種類細(xì)胞，然后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、Weste

3、rnBlot技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測MyoG啟動子在不同體外培養(yǎng)細(xì)胞中啟動外源基因的特異性和啟動效率。同時(shí)，將表達(dá)質(zhì)粒注射到雄鼠股骨內(nèi)側(cè)肌肉內(nèi)，檢測啟動子在活體組織內(nèi)的表達(dá)特異性和啟動效率。
　　1.MyoG啟動子的克隆和肌肉特異表達(dá)載體的構(gòu)建
　　分別克隆出山羊和牛MyoG基因的啟動子序列，與NCBI-BLAST已報(bào)道序列進(jìn)行比對，同源性為100％;兩種MyoG啟動子分別連入pDsRed2-1骨架構(gòu)建了以紅熒光蛋白基因?yàn)闃?biāo)記

4、基因的真核表達(dá)載體pDsRed-GoatMyoG和pDsRed-BosMyoG，經(jīng)酶切和測序鑒定，證實(shí)載體構(gòu)建成功。
　　2.MyoG啟動子組織特異性及啟動效率檢測
　　表達(dá)載體pDsRed-GoatMyoG、pDsRed-BosMyoG分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞、肌管細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，觀察紅色熒光蛋白表達(dá)情況，然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和WesternBlot技術(shù)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后標(biāo)記基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)效率。結(jié)

5、果表明，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDsRed-GoatMyoG、pDsRed-BosMyoG后，肌衛(wèi)星細(xì)胞和肌管細(xì)胞在顯微鏡下均可觀察到細(xì)胞發(fā)紅色熒光，成纖維細(xì)胞沒有紅色熒光。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測得出，轉(zhuǎn)基因肌管細(xì)胞內(nèi)GoatMyoG啟動DsRed基因表達(dá)mRNA的相對量為14.07，BosMyoG啟動DsRed基因mRNA相對量為9.02，GoatMyoG啟動外源基因的效率是BosMyoG的1.55倍;通過WesternBlot技術(shù)檢測得出轉(zhuǎn)基

6、因肌管細(xì)胞內(nèi)GoatMyoG啟動DsRed蛋白的量明顯高于BosMyoG啟動DsRed蛋白的量，在成纖維細(xì)胞內(nèi)沒有檢測到DsRed蛋白質(zhì)。說明GoatMyoG啟動子在肌衛(wèi)星細(xì)胞和肌管細(xì)胞內(nèi)啟動外源基因的效率高于BosMyoG啟動子的啟動效率，且均可在肌肉組織特異性啟動外源基因表達(dá)。
　　選擇啟動效率相對較高的GoatMyoG啟動子所構(gòu)建的表達(dá)載體對小鼠進(jìn)行肌肉注射，檢測GoatMyoG啟動子在體內(nèi)組織中的啟動特異性和效率。肌肉注射

7、五天后，分別取小鼠的注射腿肌肉組織、非注射腿肌肉組織、睪丸組織、腸組織和肝臟組織，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測標(biāo)記基因DsRed在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，注射腿肌肉組織內(nèi)GoatMyoG啟動DsRed基因轉(zhuǎn)錄mRNA的相對量為212.32，非注射腿肌肉組織內(nèi)mRNA的相對量為39.76，注射腿肌肉組織和非注射腿肌肉組織內(nèi)mRNA的量均是其它組織的1.99倍以上。通過免疫組化技術(shù)在注射腿肌肉組織和非注射腿肌肉組織內(nèi)均可檢測到紅色熒光