鞘內注射人IL-10基因修飾的間質干細胞對長春新堿致神經病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用.pdf

1、本文第一部分構建bIL10和EGFP基因的雙順反子重組腺病毒載體及其在骨髓間質干細胞中的表達 目的:構建帶有hIL-10基因的腺病毒載體，并感染大鼠骨髓間質干細胞(ratmesenchymal stem cells，rMSCs)后，進一步檢測hIL-10表達從而獲得有生物活性hIL-10修飾的rMSCs(hIL10-rMSCs)。 方法:以pSNAV2.0-hIL10重組質粒為模板，PCR擴增獲得hIL10cDNA片段，

2、經酶切連接到帶有EGFP標記的pDC316-IRES-EGFP-lacZalpha載體質粒上，PmeI線性化重組質粒pDC316-hIL10-IRES-EGFP，與腺病毒包裝系統(tǒng)：AdMax轉染293包裝細胞，包裝產生復制缺陷型重組腺病毒，經反復感染293細胞擴增病毒后，進行離子交換法純化病毒，并測定病毒顆粒數(shù)、滴度。所獲重組腺病毒感染rMSCs后，通過熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察測定重組腺病毒感染rMSCs的感染率，Western- b

3、lotting法測定rMSCs hIL-10蛋白表達水平。 結論:已成功構建含hIL10和EGFP基因的雙順反子重組腺病毒載體，其對rMSCs具較高感染率并能很好地表達目的基因hIL10，這為下一步hIL-10免疫抑制治療研究奠定了實驗基礎。 第二部分脊髓膠質細胞及前炎性細胞因子在長春新堿致神經病理性疼痛中的作用及機制 目的:探討脊髓星形膠質細胞和小膠質細胞以及前炎性細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞

4、介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNFα)在長春新堿致神經病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中的作用及機制。 方法:雄性SD大鼠隨機分為模型組和對照組。模型組通過大鼠腹腔內重復注射長春新堿建立神經病理性疼痛模型；以第1次注射長春新堿為第1天，模型組第1～5天和第8～12天腹腔注射0.1mg·(kg·d)-1長春新堿注射液(以生理鹽水稀釋至1mL)。對照組注射1mL生理鹽水，余處理同模型組。通過檢測機械性痛閾(PWT)和熱痛敏潛伏期(PWL

5、)來評價動物痛行為學改變。采用免疫組織化學、逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)等方法，檢測脊髓星形膠質細胞GFAP和小膠質細胞OX-42的表達以及脊髓前炎性細胞因子IL-1β、IL-6及TNFαmRNA表達的變化，評價脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞活化情況及脊髓前炎性細胞因子表達與疼痛行為改變的關系。 結論:大鼠腹腔內重復注射長春新堿成功地建立了化學藥物致神經病理性疼痛模型；長春新堿誘發(fā)的脊髓膠質細胞活化及前炎性細胞因子IL-1β

6、、IL-6和TNFα的表達增加，可能在神經病理性疼痛的產生和維持中起著重要的作用。 第三部分鞘內注射人IL-10基因修飾的間質干細胞對長春新堿致神經病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用 目的:人IL-10基因修飾的間質干細胞(hIL10-MSCs)經皮鞘內注射入長春新堿致神經病理性疼痛大鼠蛛網膜下腔，觀察其在蛛網膜下腔存活情況及其對大鼠的鎮(zhèn)痛作用及可能機制。 方法:長春新堿反復腹腔注射制備神經病理性疼痛大鼠模型。模型大鼠60

7、只隨機分為hIL10-MSCs組、空載體-MSCs組及對照組，每組20只。hIL10-MSCs組和空載體-MSCs組分別經皮鞘內注射hIL10-MSCs細胞懸液(1×106cells/mL)以及空載體-MSCs細胞懸液(1×106cells/mL)各30uL；對照組經皮鞘內注射生理鹽水30uL。各組大鼠分別于鞘內注射前，鞘內注射后3、7、14天測定機械性痛閾(PWT)和熱痛敏潛伏期(PWL)，同時應用熒光激發(fā)、ELISA法、免疫組化及W

8、B技術檢測hIL10-MSCs在蛛網膜下腔存活情況，腰段脊髓hIL10蛋白及脊髓膠質細胞GFAP、OX-42、IL-1β、IL-6和TNFα表達情況。 結果與對照組和空載體-rMSCs組相比，hIL10-MSCs組鞘內注射后3、7、14天PWT及PWL均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，而空載體-MSCs組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；hIL10-MSCs組和空載體-MSCs組鞘內注射細胞7、14天后在

9、熒光激發(fā)下可見綠色熒光細胞，而對照組則未見綠色熒光細胞：對照組、空載體-MSCs組各時間點均未檢測到人白介素10蛋白表達，hIL10-MSCs組腰段脊髓組織人白介素10含量在鞘內注射細胞后3、7、14天分別為1.24±0.25ng/mg.2.24±0.30 ng/mg、1.82±0.29 ng/mg。與對照組及空載體-MSCs組相比，hIL10-MSCs組腰段脊髓膠質細胞GFAP、OX-42表達明顯降低，IL-1β、IL-6和TNFα表