鞘內注射間充質干細胞對大鼠神經病理性疼痛的作用及機制的研究.pdf

1、本文對鞘內注射間充質干細胞對大鼠神經病理性疼痛的作用及機制進行了研究。本研究分為三個部分：
　　第一部分：人臍帶Wharton’s jelly來源的間充質干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。
　　目的：從臍帶Wharton’s jelly中分離、培養(yǎng)得到性狀穩(wěn)定的臍帶間充質干細胞，流式細胞技術鑒定所獲取的傳代細胞，CCK-8法和流式細胞技術共同測定細胞增殖能力和細胞周期，用于后續(xù)試驗。
　　方法：從協(xié)和醫(yī)院收集健康產婦足月剖宮產

2、術后新生兒的臍帶，通過組織塊培養(yǎng)法從臍帶Wharton’s jelly中分離得到臍帶間充質干細胞，酶消化法傳代。CCK-8法和流式細胞技術共同測定第三代細胞（P3）的增殖能力和細胞周期，取對數(shù)期生長的P3代培養(yǎng)細胞應用流式細胞技術檢測間充質干細胞特異性表型CD73, CD90, CD105的表達和一些造血細胞表面標志蛋白 CD45, CD34, CD11b, CD19和人類白細胞抗原II（HLA-DR）的表達情況。
　　結果：用組

3、織塊培養(yǎng)法從臍帶Wharton’s jelly中分離得到的P3代培養(yǎng)細胞高表達間充質干細胞特異性表型CD73(94.45±2.14％), CD90(95.58±1.78%)和 CD105(95.62±1.62%)，而低表達或者不表達造血細胞表面標志蛋白CD34(0.49±0.19%), CD45(1.87±0.68%), CD19(0.33±0.11%), CD11b(0.10±0.03%)和HLA-DR(0.18±0.07%)，據此認

4、為臍帶分離得到的貼壁細胞屬于間充質干細胞；CCK-8檢測細胞生長曲線發(fā)現(xiàn)細胞前24h內增殖不明顯，2到3天后進入對數(shù)增長期并持續(xù)到第5到6天，然后到達生長平臺期；流式技術檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)處于G0/G1細胞為75.1%、S期細胞為16.3%、G2/M細胞為8.6%，表明24.9%的細胞處于增殖狀態(tài)，增殖能力比較旺盛。
　　結論：本實驗成功的通過組織塊培養(yǎng)法從臍帶中分離培養(yǎng)得到間充質干細胞，該細胞具有性狀穩(wěn)定，增殖速度快的特點。

5、>　　第二部分：鞘內注射間充質干細胞對大鼠神經病理性疼痛的治療作用。
　　目的：采用L5脊神經結扎（spinal nerve ligation，SNL)的方法建立大鼠神經病理性疼痛動物模型，經鞘內注射臍帶來源的間充質干細胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，HUC-MSCs），檢測其在大鼠脊髓能存活、分布情況以及對大鼠神經病理性疼痛癥狀的改善作用。
　　方

6、法：SPF級雄性SD大鼠40只隨機分成4組，每組10只：(1)對照組（Sham組）:僅暴露左側L5脊神經，不結扎；鞘內置管；動物疼痛模型成功后第三天蛛網膜下腔注射注射無菌PBS20ul；（2）空白組（SNL組）：結扎左側L5脊神經；鞘內置管；動物疼痛模型成功后鞘內不給予注射；（3）模型組（SNL+PBS組）：結扎左側L5脊神經；鞘內置管；動物疼痛模型成功后第三天蛛網膜下腔注射注射無菌PBS20ul；（4）治療組（SNL+HUC-MSC組

7、）：結扎L5脊神經，動物模型成功后第三天蛛網膜下腔注射間充質干細胞1x106個（重懸在20ul無菌PBS中）。于大鼠脊神經結扎模型后的第1,2,3,5,7,9,11,14天檢測各組大鼠同側的熱刺激縮足反射潛伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL)和機械刺激撤足閾值（paw withdrawal mechanical threshold， PWMT)；治療組大鼠在造模后第7天隨機取3只處死取脊髓腰膨大

8、段檢測抗人細胞核抗體（anti-human nuclei monoclonal antibody），以追蹤移植的HUC-MSCs的存活和分布情況。
　　結果：行為學檢測發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，SNL組在造模后第一天出現(xiàn)了明顯的PWMT和 PWTL下降，并且第三天下降到最低并以此狀態(tài)持續(xù)到14天。造模后第三天鞘內注射HUC-MSCs，PWMT從造模后第7天（注射后第4天）開始增加并持續(xù)到造模后14天；PWTL的趨勢和PWMT相似，增

9、加從造模后的第5天（注射后第2天）出現(xiàn)并且持續(xù)到造模后14天。免疫熒光發(fā)現(xiàn)在大鼠腰膨大段脊髓中檢測到抗人細胞核抗體的表達，主要分布在左側脊髓背角。
　　結論：本實驗通過L5-SNL成功建立了大鼠神經病理性疼痛模型；HUC-MSCs鞘內注射后，能在脊髓內存活和遷移到脊髓背角內；鞘內注射HUC-MSCs能夠明顯改善SNL大鼠的疼痛癥狀。
　　第三部分：鞘內注射間充質干細胞對大鼠神經病理性疼痛治療作用的機制研究。
　　目的：

10、研究HUC-MSCs對SNL大鼠神疼痛癥狀治療作用的機制。
　　方法：SPF級雄性SD大鼠30只隨機分成3組，每組10只：(1)對照組（Sham組）:僅暴露左側L5脊神經，不結扎；鞘內置管；動物疼痛模型成功后第三天蛛網膜下腔注射注射無菌PBS20ul；（2）模型組（SNL+PBS組）：結扎左側L5脊神經；鞘內置管；動物模型成功后第三天蛛網膜下腔注射注射無菌PBS20ul；（3）治療組（SNL+HUC-MSC組）結扎L5脊神經，動物

11、模型成功后第三天蛛網膜下腔注射間充質干細胞1x106個（重懸在20ul無菌PBS中）。各組大鼠在造模后14天處死取材檢測。EILSA方法檢測左側脊髓背角中的炎癥因子 IL-1β， IL-17A和 IL-10和血清中炎癥因子IL-1β，IL-17A的表達水平；Western blot檢測脊髓背角中BDNF蛋白的相對含量；免疫熒光和Western blot檢測左側脊髓背角里激活的的星型膠質細胞標志物GFAP和小膠質細胞激活標志物IBA-1的

12、表達情況。
　　結果：與Sham組相比，ELISA結果表明SNL大鼠左側脊髓背角的促炎癥因子IL-1β和IL-17A明顯增加，抗炎因子IL-10并未發(fā)現(xiàn)明顯的改變；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)BDNF的蛋白合成增加；免疫熒光可以看到 SNL大鼠背角中的星型膠質細胞和小膠質細胞明顯激活，表現(xiàn)為GFAP和IBA-1陽性標志的細胞數(shù)量增多，Western blot檢測結果與免疫熒光結果一致， GFAP蛋白和 IBA-1蛋白量明顯增加

13、。鞘內給予HUC-MSCs治療后，與SNL組相比，促炎因子IL-1β和IL-17A顯著減少，同時增加促炎因子IL-10的水平；免疫熒光觀測到左側脊髓背角的GFAP陽性的細胞和IBA-1陽性的細胞數(shù)量減少，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)GFAP蛋白和IBA-1蛋白量顯著減少。造模后第14天血清的IL-1β和 IL-17A在 Sham組、SNL組、SNL+HUC-MSC沒有統(tǒng)計學意義。
　　結論：HUC-MSCs對SNL大鼠疼痛起著