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文檔簡介
1、目的:人臍帶來源的間充質(zhì)干細胞作為一種新的種子細胞來源越來越受到人們的重視。先前的研究表明從人臍帶組織中分離的間充質(zhì)干細胞既具有增殖能力,又具有向多細胞(神經(jīng)元樣細胞、星形膠質(zhì)細胞、脂肪細胞及少突膠質(zhì)細胞等)分化的能力<'[1、2]>,加之來源廣泛、取材容易,在細胞移植、基因治療、組織工程中有廣闊的應(yīng)用前景。然而,我們在過去四年的研究中體會到從人臍帶分離間充質(zhì)干細胞并非易事,特別是如何快速、高效的從臍帶中獲得MSC以滿足基礎(chǔ)和未來臨床研
2、究的需要是一個亟待解決的問題。為此,本課題對不同胎齡胎兒臍帶和不同培養(yǎng)方法對分離人臍帶間充質(zhì)干細胞的影響進行了研究。 方法: 1 人臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng):(1)組織貼塊法:分別取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶35例及流產(chǎn)胎兒臍帶33例,以PBS充分沖洗,剔除臍帶動、靜脈,將其余的臍帶間質(zhì)組織切割成直徑約1mm大小的組織塊,在含有20%的胎牛血清、2mM左旋谷氨酰氨(L-Glu)、100<'U>/ml青霉素,10μg/ml鏈
3、霉素的低糖型培養(yǎng)基(HG-DMEM)中培養(yǎng),原代培養(yǎng)3-7天后,顯微鏡下可見大量細胞自組織塊中游出,向外呈放射狀貼壁生長。待細胞達到80%-90%匯合后,加入0.2%胰酶消化傳代。收集MSCs臍帶間充質(zhì)干細胞后凍存待用。(2)膠原酶.胰酶消化法:分別取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶17例及流產(chǎn)胎兒臍帶15例,超凈臺內(nèi)取出臍帶PBS充分洗滌,沖去臍靜脈及動脈內(nèi)的殘存血,將臍帶剪碎至1 mm3大小組織塊,移至0.1%膠原酶Ⅳ中,37℃持續(xù)攪拌
4、消化30 min;隨即向膠原酶一組織塊消化體系內(nèi)加入終濃度為0.1%的胰酶在37℃環(huán)境中繼續(xù)攪拌消化30 min;10%FBS終止消化,用細胞篩過濾,將含細胞的濾液進行離心。細胞接種于LG-DMEM培養(yǎng)基的T-25塑料培養(yǎng)瓶中。3,4 d后,更換培養(yǎng)基,去掉未貼壁細胞。以后每3天換液1次,至細胞融合傳代。 2 將貼壁的干細胞消化。加入0.2%胰酶/0.2%EDTA,待細胞大部分變成圓形后,加入含有10%FBS的DMEM中止消化
5、,吹打貼壁細胞使貼壁細胞變成懸浮狀態(tài)。1000rpm離心10分鐘,棄上清液,PBS洗滌(去除剩余的血清等)。室溫下,1000rpm離心10分鐘,臺盼藍染色法評估細胞活性,并進行細胞計數(shù)。安每管3-4×10 5分成12管各管中加入下述PE、FITC、PERCP、及APC標記的小鼠抗人單克隆抗體5ul,充分混勻,4℃避光孵育30分鐘。1800rpm離心5分鐘,去除上清液,加入2MLBS 1000rpm離心兩次,各5分鐘。調(diào)整最終容積為200
6、ML,上機進行流式細胞檢測。同時以小鼠FITC、PE、APC、PERCP標記的IgG1作為同型對照。所用抗體包括:PE-CDl3、FITC-CDl4、APC-CD29、FITC-CD31、FITC-CD34、PE-CD38、PE-CD44,PERCP-CD45, APC-CD90、FITC-CD105、PE-CD133、PE-CD166、HLA-DR。 結(jié)果: 1.組織塊原代培養(yǎng):足月齡臍帶組約1周左右,可見細胞自組織
7、塊游出,貼壁呈放射狀生長,形態(tài)較均一,呈長梭形。經(jīng)10天左右達到80%-90%匯合,鏡下可見細胞胞漿豐富,軸突伸長,多角狀。消化后以1:2-1:3的比例傳代細胞,接種約30分鐘后細胞開始貼壁,6-8小時貼壁完全,傳代后經(jīng)換液3-5天完全匯合時鏡下可見細胞排列緊密,無序生長,小月齡臍帶組約4-5天左右可見細胞游出,經(jīng)5天左右達到80%-90%匯合,細胞傳代增殖特點與足月組相似。第2天即看見有少量形態(tài)各異的貼壁細胞,散在分布。 2.
8、膠原酶.胰酶消化法:第2天即看見有少量形態(tài)各異的貼壁細胞,散在分布長梭形細胞間可見少量鵝卵石樣細胞組成的集落,考慮為臍靜脈內(nèi)皮細胞。長梭形細胞即為MSC細胞,其形態(tài)類似于成纖維細胞,增殖能力旺盛,約1周左右時,貼壁細胞形成集落,占優(yōu)勢的是成纖維樣細胞,此外還有臍靜脈內(nèi)皮細胞,至2周左右可達到80%融合,臍靜脈內(nèi)皮細胞生長則受到明顯抑制。2.5g/L胰酶消化,傳代后可得到較純化的成纖維樣細胞。 3.流式細胞學檢測結(jié)果顯示:對小月齡
9、胎兒臍帶培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞進行免疫表型分析表明:CD13、CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽性表達,本實驗結(jié)果表明,UCMSCs表達間充質(zhì)細胞特異性抗原標志而不表達造血干細胞、內(nèi)皮細胞特異性標志。這和足月胎兒臍帶流式檢測結(jié)果一致。并與骨髓、臍血、胎肺等其他組織來源的MSCs流式檢測結(jié)果也一致。對CD13、CD29、CD44、CD90的表達達97%以上說明細胞成分比較均一。 4.統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示:UC-MSC的原代培
10、養(yǎng)中小月齡胎兒組細胞爬出、首次達80%融合時間、細胞總數(shù)達到106的時間及培養(yǎng)成功率均明顯早于足月胎兒組,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),傳代以后的細胞增值時間相近,無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。組織貼塊組成功率明顯高于酶源消化法,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結(jié)論: 本實驗中小月齡胎兒臍帶培養(yǎng)的MSC在原代培養(yǎng)中周期明顯較足月胎兒臍帶培養(yǎng)的MSC短,應(yīng)用組織貼塊法培養(yǎng)成功率高于酶原消化法,可在更短時間內(nèi)獲的所需細胞
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