人臍帶沃頓膠間充質干細胞的分離培養(yǎng)及其誘導分化.pdf

1、第一章人臍帶沃頓膠間充質干細胞的分離和培養(yǎng)
　　 目的：建立一種簡便、快捷、經濟、高效臍帶沃頓膠間充質于細胞的獲取方法。
　　 方法：臍帶剔除血管和外膜后，余下的膠凍狀組織，即沃頓膠(Wharton'sjelly,WJ)剪碎至1-2ram3大小，按一定比例均勻放置于含FasGrow培養(yǎng)基的6孔板中，37℃、5％的C02培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。待細胞游出后，用胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)并入液氮凍存。取第5代細胞行HE、Gimesa染色，觀

2、察細胞形態(tài)。
　　 結果：沃頓膠組織靜置培養(yǎng)7天左右，部分細胞從組織塊中游出，多為雙突起的長梭形、短棒狀或扁平形的成纖維樣細胞；14天左右，細胞形態(tài)變?yōu)榫坏募忓N形，細胞生長達到單位面積的70％～80％。傳代后可維持未分化狀態(tài)并穩(wěn)定增殖，細胞倍增時間為3d左右，體外增殖達20代以上；P3代以后，細胞形態(tài)較單一。復蘇后的細胞能很好生長，細胞形態(tài)，生長特點與凍存前基本一致。
　　 結論：種植法簡單、快捷、經濟、高效，能從臍帶

3、沃頓膠中分離出大量成纖維樣細胞。
　　 第二章人臍帶沃頓膠間充質干細胞的鑒定及誘導分化
　　 目的：判斷從臍帶沃頓膠中分離出的成纖維樣細胞是否是臍帶沃頓膠間充質干細胞，并確定其分化潛能。
　　 方法：取第5代細胞進行免疫組化，檢測其免疫表型。用含地塞米松、維生素C、B-甘油磷酸鈉的FasGrow培養(yǎng)基誘導該成纖維樣細胞向成骨細胞分化，并進行堿性磷酸酶染色、VonKossa染色及四環(huán)素染色鑒定成骨細胞特性；用含地塞

4、米松、維生素C、異丁基甲基黃嘌呤的FasGrow培養(yǎng)基誘導該成纖維樣細胞向成脂細胞分化，并進行油紅O染色鑒定成脂細胞特性；用含β-巰基乙醇的FasGrow培養(yǎng)基誘導該成纖維樣細胞向神經樣細胞分化，并通過特異性抗體鑒定其分化能力。
　　 結果：表面標記分析顯示：CD44、CDI05、CD133、MHC-I呈陽性，CD34、CD45呈陰性，從臍帶沃頓膠中分離出的成纖維樣細胞為間充質干細胞；體外誘導實驗表明：該細胞具有體外成脂肪、成骨