紅景天苷調(diào)控大鼠顱骨成骨細胞表型表達及相關機制的研究.pdf

1、目的：通過多次酶消化的方式獲取新生24小時大鼠顱骨成骨細胞（rat calvarial osteoblasts, ROB），并以其為研究模型，觀察常氧條件下不同濃度的紅景天苷（salidroside, SAL）對成骨細胞增殖、分化和礦化的調(diào)控作用，并對其可能的作用機制進行了初步探討，同時還觀察了SAL對成骨細胞低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1α）及其下游靶基因血管內(nèi)皮生長

2、因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的調(diào)控作用。
　　方法：1、利用酶消化的方式獲取 ROB細胞，通過差速貼壁法純化 ROB細胞，經(jīng)過活細胞形態(tài)學的觀察、堿性磷酸酶Gomori鈣-鈷法染色及礦化結節(jié)茜素紅染色法來鑒定 ROB細胞，取第三代純化度達90％以上者用于實驗。2、利用 MTS法檢測ROB細胞的增殖活性。3、利用磷酸苯二鈉法，使用堿性磷酸酶（alkaline phospha

3、tase, ALP）試劑盒測定 SAL對成骨細胞早期分化的標志性基因 ALP活性的影響。4、利用反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）法檢測成骨細胞晚期分化的標志性基因骨鈣素（osteocalcin, OC）、成骨細胞特異性轉錄因子 Osterix（Osx）和Runx2及 HIF-1α、VEGF的mRNA表達水平。5、利用酶聯(lián)免疫吸附實驗（e

4、nzyme-linked immnosorbent assay, ELISA）測定 OC、VEGF及成骨細胞早、中期分化的標志性基因 I型膠原（Collagen Type1, Col-1）的分泌水平。6、利用茜素紅染色和定量分析法檢測SAL對ROB礦化功能的影響。
　　結果：1、獲取的ROB細胞經(jīng) Gomori鈣-鈷法染色后胞質(zhì)內(nèi)有灰黑色的顆粒及塊狀沉淀出現(xiàn)。ROB細胞經(jīng)不傳代培養(yǎng)13天可形成礦化結節(jié)，在倒置顯微鏡下觀察呈黑色不透

5、明區(qū)，其經(jīng)茜素紅染色后呈現(xiàn)紅色。2、SAL可顯著促進 ROB細胞增殖。3、SAL能顯著增加 ROB細胞中 ALP、Col-1及 OC的含量促進細胞分化成熟。4、SAL能夠促進ROB細胞礦化形成礦化結節(jié)。5、SAL能顯著促進成骨細胞分化的特異性轉錄因子Oterix和Runx2的mRNA轉錄水平增高。6、SAL能上調(diào)HIF-1α及其下游靶基因VEGF的表達。
　　結論：SAL可以促進ROB細胞增殖、分化及礦化；上述作用可能與SAL上調(diào)