HIV Vpr通過上調(diào)miR-122表達促進丙型肝炎病毒RNA復制及其蛋白合成.pdf

1、背景和目的:
　　HIV和HCV因有著共同的傳播途徑，其混合感染在臨床上很常見。大量的研究證實在HIV/HCV混合感染患者中肝硬化和肝癌的發(fā)生率較HCV單獨感染患者明顯增高，且混合感染患者生存率降低，流行病學資料亦證實HIV/HCV混合感染者血清中HCVRNA載量較HCV單獨感染者明顯升高，提示HIV促進HCV復制，可能為HIV/HCV混合感染患者中HIV導致HCV肝臟疾病加重的主要原因。但到目前為止HIV/HCV混合感染中HIV

2、影響HCV復制的具體機制仍未明確，且此方面的研究甚少，臨床治療措施有限，因此，開展HIV影響HCV復制分子發(fā)病機制的研究，一直是國內(nèi)外HIV/HCV混合感染研究領域的亮點，且具有重要的臨床與科學價值。HIV蛋白被發(fā)現(xiàn)在HIV影響HCV復制的過程中扮演著重要角色，而Vpr蛋白作為HIV重要的輔助蛋白之一，通過其介導HIV整合前復合物(preintegration complex，PIC)的核運輸，進而促進HIV-1感染未分化細胞;通過誘導

3、細胞周期停滯在G2分裂期，調(diào)控HIV-1長末端重復序列(LTR)及宿主基因的轉(zhuǎn)錄激活，并調(diào)節(jié)NF-κB的活性，因而在HIV的持續(xù)感染和致病過程中有著重要作用。在本研究中，我們探討了Vpr對HCV復制的影響及其調(diào)控機制，旨在為HIV影響HCV復制的機制提供新的實驗依據(jù)。
　　方法:
　　通過構(gòu)建HCV5'UTR驅(qū)動的熒光素酶報告基因和miR-122啟動子驅(qū)動的熒光素酶報告基因，通過使用兩種HCV感染細胞模型，HCVJFH1感染

4、細胞模型和OR6細胞模型，采用熒光定量PCR技術(shù)、免疫蛋白印跡和熒光素酶活性實驗檢測Vpr對HCVRNA復制和HCV蛋白表達的影響。通過雙熒光素酶活性實驗檢測Vpr對HCV5'UTR活性的調(diào)控影響。此外，通過雙熒光素酶活性實驗和Realtime PCR檢測Vpr對miR-122啟動子活性、precusormiR-122和miR-122 mRNA轉(zhuǎn)錄影響。進一步通過使用miR-122抑制劑抑制miR-122的表達，予以熒光素酶活性實驗、熒

5、光定量PCR技術(shù)和免疫蛋白印跡檢測miR-122在Vpr上調(diào)HCV5'UTR活性，促進HCVRNA復制和HCV蛋白表達中的影響。
　　結(jié)果:
　　通過構(gòu)建HCV5'UTR驅(qū)動的熒光素酶報告基因，我們發(fā)現(xiàn)Vpr可上調(diào)HCV5'UTR的活性，呈劑量依賴性。另外，通過使用Molt-4細胞和Huh7.5.1細胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vpr可從淋巴細胞中分泌出來，獨立進入肝細胞中發(fā)揮生物學效應。Vpr在JFH1感染細胞系統(tǒng)中顯著促進HCVR

6、NA的復制和HCV蛋白的表達;在OR6細胞中，Vpr同樣可明顯上調(diào)HCV海腎熒光素酶活性，并增強HCV蛋白的表達。Vpr穩(wěn)定表達細胞株予以HCVJFH1感染后也證實Vpr可在JFH1感染后72小時和30d均明顯促進HCVRNA的復制及增強HCV蛋白的表達。進一步的研究表明Vpr可通過上調(diào)miR-122的啟動子活性，precusor miR-122和miR-122 mRNA轉(zhuǎn)錄進而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)miR-122的表達。另外，使用針對miR-

7、122的抑制劑，能顯著阻斷Vpr對HCV5'UTR的上調(diào)作用，同樣還可在JFH1感染系統(tǒng)和OR6細胞中miR-122抑制劑顯著廢除Vpr對HCVRNA復制和HCV蛋白的影響。
　　結(jié)論:
　　我們的研究結(jié)果證實Vpr通過上調(diào)miR-122的轉(zhuǎn)錄水平，并上調(diào)HCV5'UTR的活性，從而促進HCVRNA的復制和增強HCV蛋白的表達。同時首次發(fā)現(xiàn)Vpr可從淋巴細胞中分泌出來，獨立地進入肝細胞中發(fā)揮生物學效應。這些研究結(jié)果說明miR