丙型肝炎病毒核心蛋白通過轉(zhuǎn)錄因子Snail下調(diào)E-cadherin表達的分子機制研究.pdf

1、目的:原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是威脅人類健康最嚴重的惡性腫瘤之一，導致肝癌發(fā)生的原因很多。丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染是導致HCC發(fā)生的重要危險因素。全球約有1.7億人感染HCV，其中80％的成年患者將發(fā)展成慢性丙型病毒性肝炎，進而進展為肝纖維化，肝硬化甚至肝癌。原發(fā)性肝癌病死率高，其中一個主要原因是腫瘤惡性程度高，較早發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前許多實驗支持HCV編碼的

2、蛋白，尤其是核心蛋白在HCV相關肝臟疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮主要的作用，同時還參與HCC的惡性轉(zhuǎn)移過程，但其具體機制不明。
　　上皮樣細胞向間質(zhì)樣細胞轉(zhuǎn)化(EMT)的過程是上皮細胞受到刺激后，失去粘著蛋白(E-cadherin)對細胞之間的緊密連接，上皮細胞基底膜極性被破壞，細胞之間變得疏松，并進一步獲得間質(zhì)樣細胞特有的應力纖維（fibronectin）、波形蛋白(vimentin)，細胞最終具有遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的能力。以往研究者對E

3、MT的認識多集中在胚胎發(fā)育期，即EMT在正常的胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，例如EMT參與中胚層、心臟發(fā)育及神經(jīng)嵴的形成。近年來EMT參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲得到廣泛關注，有研究報道顯示，在乳腺癌、胰腺癌、結腸癌、肝癌以及黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)EMT參與腫瘤的遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移。但是EMT參與HCV感染相關的原發(fā)性肝癌惡性轉(zhuǎn)移過程的具體機制仍不清楚。
　　發(fā)生上皮樣細胞向間質(zhì)樣細胞轉(zhuǎn)變(EMT)的細胞表型改變主要包括:細胞遷移能力、侵襲能力增強，

4、細胞凋亡受到抑制。EMT的典型分子標志物包括:上皮細胞標志物E-cadherin表達下調(diào)，間質(zhì)細胞重要指標vimentin，N-cadherin，fibronectin表達增加，β-catenin出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位;與此同時調(diào)控E-cadherin表達的抑制性轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào)，如Snail、Slug、 ZEB1、ZEB2、E47等。
　　粘著蛋白E-cadherin是構成細胞間緊密連接的功能蛋白。當缺失E-cadherin時，細胞的侵襲、

5、轉(zhuǎn)移能力都顯著增加，而回復腫瘤細胞中E-cadherin表達，發(fā)現(xiàn)細胞表現(xiàn)為上皮表型，同時細胞的遷移能力降低;除此之外，異位表達的E-cadherin，可以使間質(zhì)細胞特異表達基因的轉(zhuǎn)錄受阻。因此，E-cadherin的表達缺失被視為EMT發(fā)生的重要標志。
　　研究顯示SNAIL轉(zhuǎn)錄因子超家族Snail通過識別保守的5'-CAGGTG-3'序列，直接與E-cadherin(CDH1)啟動區(qū)上的E-box結合，負性調(diào)控CDH1啟動子活

6、性，進而抑制E-cadherin的表達。最新研究表明，肝癌組織中E-cadherin的低表達與Snail負相關，腫瘤組織中高表達Snail，肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移率高，患者預后較差。課題組前期實驗表明:體外肝癌細胞模型中HCV核心蛋白能夠下調(diào)E-cadherin的表達，但是HCV核心蛋白能否通過轉(zhuǎn)錄因子Snail下調(diào)E-cadherin表達，從而促進肝癌細胞的遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移，目前還未見報道。本研究旨在進一步探討核心蛋白調(diào)控E-cadheri

7、n表達的分子機制及參與肝癌發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移的作用。
　　方法:采用細胞劃痕、遷移實驗、RT-PCR、Western blot、免疫熒光及siRNA干擾技術驗證HCV核心蛋白誘導肝癌細胞由上皮樣細胞向間質(zhì)樣細胞的轉(zhuǎn)化，分析HCV核心蛋白誘導EMT進程的相關信號通路。進一步采用基因重組技術構建E-cadherin(CDH1)啟動子區(qū)報告質(zhì)粒及CDH1啟動子區(qū)E-box突變報告質(zhì)粒，分析HCV核心蛋白對CDH1啟動子活性的調(diào)控作用;通過染色

8、質(zhì)免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation，ChIP)、免疫共沉淀（Immunoprecipitation，IP）方法研究核心蛋白調(diào)控CDH1基因的分子機制。體內(nèi)實驗通過裸鼠肝癌皮下移植瘤模型和肝臟原位移植瘤模型，研究HCV核心蛋白對肝癌細胞增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響。進一步采用H&E染色和免疫組化方法檢測裸鼠肝臟原位移植瘤模型中Core、Snail、E-cadherin以及侵襲相關分子VEGF，MMP-2，

9、MMP-9的表達。
　　結果:在瞬時或穩(wěn)定表達HCV核心蛋白的Huh7細胞中， HCVCore下調(diào)上皮細胞重要標志物E-cadherin，增強間質(zhì)細胞標志物vimentin的表達，引起肝癌細胞EMT的發(fā)生，此現(xiàn)象同時在HCV體外復制模型中得到驗證。核心蛋白過表達的Huh7細胞中，回復E-cadherin的表達可以部分阻斷HCV Core誘導肝癌細胞EMT的發(fā)生，說明HCV Core誘導肝癌細胞EMT的發(fā)生與細胞中E-cadheri

10、n的缺失表達密切相關。進一步研究HCV Core誘導EMT發(fā)生的相關信號通路發(fā)現(xiàn)，HCV Core對調(diào)控EMT常見信號通路TGF-β無明顯激活作用，其通過激活Akt/GSK-3β信號通路，增加Snail的穩(wěn)定性，從而抑制 E-cadherin的表達，引起肝癌細胞EMT的發(fā)生。
　　HCV Core介導Snail結合于CDH1啟動子區(qū)的E-box1(-80～-75)，E-box3(-30～-25)，E-box4(+22～+27)，抑

11、制CDH1的啟動子活性，其中發(fā)揮主要負性調(diào)控作用的是E-box1、3，并且兩者之間具有協(xié)同作用。深入分析發(fā)現(xiàn):HCV Core可以增強Snail結合于CDH1啟動子區(qū)，同時Core還可以與Snail形成復合物，共同結合于CDH1啟動子區(qū)，抑制E-cadherin的表達。因此，在過表達核心蛋白的Huh7細胞中證實:HCV Core能與Snail直接結合，形成轉(zhuǎn)錄抑制復合物，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄。
　　裸鼠肝癌皮下移植瘤模型

12、發(fā)現(xiàn):HCV Core通過穩(wěn)定Snail，下調(diào)E-cadherin的表達，增強MMP-2、MMP-9、VEGF等的表達，促進異位移植瘤的生長，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。肝臟原位移植瘤模型實驗結果表明:HCV Core能誘導肝癌細胞在肝內(nèi)發(fā)生廣泛性轉(zhuǎn)移，部分裸鼠發(fā)生肺部的遠處轉(zhuǎn)移。采用siRNA技術特異沉默Snail表達，可以明顯降低HCV Core誘導的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移。E-cadherin的表達明顯回復，MMP-2、MMP-9以及

13、VEGF表達顯著下調(diào)。體內(nèi)皮下移植瘤模型和肝臟原位移植瘤模型的結果證實:HCV Core增強肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而沉默Snail的表達可以明顯抑制Core促腫瘤增殖與遷移效應，充分說明Core促腫瘤效應依賴轉(zhuǎn)錄因子Snail的參與。
　　結論:我們通過體外和體內(nèi)實驗證實HCV Core通過激活Akt/GSK-3β信號通路穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子Snail，從而下調(diào)上皮細胞標志物E-cadherin的表達，促進HCV感染相關肝癌細胞