重組質(zhì)粒pSecTag2HygroC-CD13-1-RFP轉(zhuǎn)染293細胞及目的蛋白表達的檢測.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、[目的]：應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，介導含目的基因pSecTag2HygroC/CD13-1/RFP的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，并用熒光顯微鏡和Westernblot檢測其轉(zhuǎn)染成功率和目的蛋白的表達，為進一步研究重組CD13單鏈抗體對血液腫瘤的靶向殺傷作用打下了實驗基礎(chǔ)。 [方法]： 1質(zhì)粒經(jīng)感受態(tài)E.coliDH5a擴增后，參照質(zhì)粒提取試劑盒(QIAgenplasmidMegakit試劑盒)說明提取、純化質(zhì)粒.并用紫外分光光度

2、計測定DNA含量和純度。 2.DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)293細胞(37℃，5％CO2)。 3.采用Lipofectamine2000方法將包含目的基因pSecTag2HygroC/CD13-1/RFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞。在轉(zhuǎn)染24h后于熒光顯微鏡下觀察RFP紅色熒光蛋白紅色熒光出現(xiàn)情況。 4.收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后293細胞的上清液，并濃縮上清液。提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293細胞的細胞膜蛋白和胞漿蛋白。將濃縮的上清蛋白與提取的胞膜

3、蛋白和胞漿蛋白同時進行Westernblot鑒定。 [結(jié)果]: 1.熒光顯微鏡下可觀察到RFP紅色熒光蛋白所發(fā)出的紅色熒光. 2.Westernblot鑒定結(jié)果：提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293細胞胞漿蛋白Westernblot鑒定可見到大小為62KD左右的條帶。濃縮的上清蛋白與提取的胞膜蛋白Westernblot鑒定未見到目的蛋白表達。 [結(jié)論]: 1、應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，成功介導目的基因pSecTag2H

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