CD13單鏈抗體和AGAP重組蛋白真核表達及對NB4細胞的殺傷作用.pdf

1、目的：本研究應用基因工程技術方法，構建含重組編碼CD13單鏈抗體和蝎毒素鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽AGAP（analgesic antitumoral peptide，AGAP）融合蛋白基因的真核表達載體，在真核細胞中表達并純化融合蛋白，并研究CD13-AGAP融合蛋白對CD13陽性白血病細胞株NB4影響。 方法：從東亞鉗蝎蝎尾中PCR擴增東亞鉗蝎活性肽AGAP的編碼基因，酶切后插入真核表達載體pSecTag2/CD13/RFP，連接轉

2、化，酶切鑒定后得到pSecTag2/CD13/AGAP重組真核表達載體。測序鑒定后，LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑介導重組質粒轉染293T細胞，通過RT-PCR和免疫印跡方法檢測融合基因和蛋白在真核細胞中的表達。進一步用ProBondTM Nickel-Chelating Resin純化柱結合并純化真核表達融合蛋白CD13-AGAP，低溫凍干濃縮融合蛋白表達純化融合蛋白。將CD13-RFP融合蛋白作用NB4細胞，室

3、溫孵育30 min，流式檢測細胞紅色熒光蛋白表達，分析CD13-RFP單鏈抗體融合蛋白特異性結合CD13陽性NB4細胞的能力；將CD13-RFP和CD13-AGAP融合蛋白作用CD13陽性白血病細胞株NB4細胞，CCK8檢測細胞存活率；流式細胞儀檢測CD13-AGAP融合蛋白對NB4白血病細胞株細胞周期的影響。 結果： （1）酶切及測序結果證實pSecTag2/CD13/AGAP重組真核表達載體構建成功； （2）

4、將融合表達載體轉染293T細胞，48 h后分別收集細胞總RNA和蛋白，RT-PCR和免疫印跡方法結果證實重組質粒得到有效表達； （3）大量培養(yǎng)轉染了CD13-AGAP融合蛋白表達質粒的293T細胞，液氮和42℃水浴反復凍融裂解細胞，用ProBondTM Nickel-Chelating Resin純化柱結合并純化真核表達融合蛋白CD13-AGAP，低溫凍干濃縮融合蛋白； （4）流式檢測CD13-RFP單鏈抗體融合蛋白特異

5、性結合CD13陽性NB4細胞，將CD13-RFP融合蛋白加入到1×105NB4細胞，室溫孵育30 min，流式檢測細胞紅色熒光蛋白表達，發(fā)現有42%細胞CD13陽性，證明真核表達的CD13-RFP可以有效結合CD13陽性NB4細胞。 （5）將融合蛋白CD13單鏈抗體和CD13單鏈抗體AGAP融合蛋白作用白血病CD13陽性細胞株NB4，96 h后，對腫瘤細胞的生長抑制分別為16．3%和42．8%； （6）流式細胞儀分析CD

6、13-AGAP融合蛋白對NB4細胞周期的影響，融合蛋白CD13-AGAP處理NB4細胞后，使細胞周期G1期比例從對照的42．26%增加到55．97%多，S期從53．67%減少到38．18%。 結論： （1）成功構建了融合蛋白真核表達載體pSecTag2/CD13/AGAP，并在293T細胞中成功表達并純化融合蛋白. （2）融合蛋白對CD13陽性的腫瘤細胞NB4有特異結合作用，結合了AGAP的CD13單鏈抗體融合蛋