質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)BRL細(xì)胞HP450基因表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：以pGPH1/GFP/Neo質(zhì)粒為載體，設(shè)計(jì)構(gòu)建特異性針對(duì)HP450基因 shRNA真核表達(dá)載體，并通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染正常的大鼠肝細(xì)胞株（BRL），以探討靶向干擾HP450基因?qū)RL細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，為今后研究HP450基因?qū)RL細(xì)胞功能的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：1. pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表達(dá)載體的構(gòu)建：針對(duì)HP450基因設(shè)計(jì)合成特異性DNA片段以及一對(duì)無(wú)關(guān)序列的陰性對(duì)照DNA片段，將它們插

2、入真核表達(dá)質(zhì)粒 pGPH1/GFP/Neo中構(gòu)建重組載體。2.大鼠肝細(xì)胞株BRL pGPH1/GFP/Neo-HP450質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染：應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組的pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至大鼠肝細(xì)胞株（BRL），并于轉(zhuǎn)染后6h、12h、24h在熒光倒臵顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。3. pGPH1/GFP/Neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BRL對(duì)HP450基因表達(dá)的影響：實(shí)驗(yàn)分為三組，即空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-

3、聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)各組HP450基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析。4. pGPH1/GFP/Neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BRL對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響：采用MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的周期時(shí)相分布。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建針對(duì) HP450基因 shRNA真核表達(dá)載體pGPH1/GFP/Neo-HP450，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞株 BRL，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示該重組載體能夠特異性下調(diào)BRL

4、細(xì)胞中HP450的表達(dá)水平，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組對(duì)比，差異有顯著性（P<0.05），HP450基因表達(dá)下調(diào)達(dá)40％。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組比較，MTT結(jié)果顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組對(duì)BRL細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用（P<0.05）；流式細(xì)胞術(shù)顯示G1期空白對(duì)照組細(xì)胞為86.45%，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為58.30%，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比空白對(duì)照組降低了32.56%；S期細(xì)胞空白對(duì)照組為8.29%，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為30.57%，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組比較提高了2.69倍，結(jié)果提