超聲聯(lián)合白蛋白微泡造影劑介導(dǎo)的基因靶向轉(zhuǎn)染.pdf

1、隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和基因工程技術(shù)的改進(jìn)，基因治療的研究不斷取得進(jìn)步，超聲微泡造影劑的應(yīng)用使得超聲醫(yī)學(xué)不僅在診斷方面有所創(chuàng)新，而且其在基因治療方面潛在的應(yīng)用價值也備受關(guān)注，具有廣闊的應(yīng)用前景。 基因治療時，治療基因必須到達(dá)靶細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞核，然后再經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯為蛋白質(zhì)，才能起到治療作用，基因?qū)塍w內(nèi)的方法有直接注射和靜脈注射法，如果不用某種方式使這些治療性基因保持穩(wěn)定，經(jīng)靜脈注射后通常會被血清酶快速清除，或很難通過內(nèi)皮細(xì)胞屏障

2、。在靜脈給藥途徑中，要防止基因物質(zhì)在血液中被降解，人們已經(jīng)嘗試各種不同的被覆物質(zhì)作為基因的載體來改善基因物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，新近研究發(fā)現(xiàn)，超聲微泡聲學(xué)造影劑可成為基因治療中一種安全、有效的載體，在聲像圖的監(jiān)控下進(jìn)行超聲輻照，微泡能夠在指定部位“爆破”，釋放出所攜帶的基因。國內(nèi)外學(xué)者對此在活體動物研究領(lǐng)域僅取得一些初步進(jìn)展，需要對超聲及微泡增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染的方法學(xué)和機(jī)制進(jìn)行深入探討，這些對于超聲及微泡做為一種新型的基因載體在基因治療領(lǐng)域中的發(fā)展與高層

3、次理解至關(guān)重要。本文擬通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(EGFP)僅在大鼠骨骼肌微血管通透性增加的條件下表達(dá)的可行性并評價超聲聯(lián)合白蛋白微泡造影劑實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染的靶向性。為建立一種新型、安全、高效的基因轉(zhuǎn)染模式奠定初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第一部分：超聲聯(lián)合微泡造影劑對大鼠脊斜肌微血管通透性的影響 目的：研究治療劑量超聲破壞微泡造影劑對大鼠脊斜肌毛細(xì)血管通透性的影響。 方法：以伊文思藍(lán)(EvansBlue,EB)為指

4、示劑，18只清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，隨機(jī)均分為伊文思藍(lán)組(E)、伊文思藍(lán)+超聲組(E+U)和伊文思藍(lán)+超聲+微泡組(E+U+M)共3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。給予相同參數(shù)條件的超聲進(jìn)行照射，經(jīng)頸動脈輸／不輸入微泡造影劑，應(yīng)用在體熒光顯微鏡觀察EB外溢情況并行視覺評分；使用標(biāo)準(zhǔn)曲線和分光光度法測量各組大鼠脊斜肌中EB的含量。 結(jié)果：E+U+M組鏡下可見微血管周圍EB外溢，視覺評分等級為2級，E組評分0級，E+U組評分0-

5、1級。E+U+M組脊斜肌中EB含量為(51.57±3.89)μg/g，顯著高于E組[(28.99±4.67)μg／g]及E+U組[(30.99±4.11)μg／g](P=0.000)。E組及E+U組兩者相比無顯著性差異。 結(jié)論：超聲介導(dǎo)微泡造影劑破壞可使大鼠脊斜肌組織毛細(xì)血管通透性增加，可能是超聲微泡造影劑增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染的主要機(jī)制之一。 第二部分：超聲微泡造影劑介導(dǎo)EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠脊斜肌的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討增

6、強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(EGFP)在大鼠脊斜肌微血管通透性增加的條件下表達(dá)的可行性。 方法：20只清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，隨機(jī)均分為裸質(zhì)粒組(P)、質(zhì)粒+超聲組(P+U)、質(zhì)粒+微泡組(P+M)和質(zhì)粒+超聲+微泡組(P+U+M)共4組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選擇增強(qiáng)綠色熒光蛋白質(zhì)粒與白蛋白微泡相混合，以超聲介導(dǎo)白蛋白微泡破裂的方法對大鼠脊斜肌行基因轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染7d后，熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒在大鼠脊斜肌組織中的表達(dá)情況。

7、 結(jié)果：P、P+M組大鼠脊斜肌組織中均未見增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)；P+U組可見少量微弱綠色熒光，熒光強(qiáng)度較P和P+M組顯著增強(qiáng)(P<0.05)，P+U+M組可見顯著特異性增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)，熒光強(qiáng)度約為P、P+M組的10倍，P+U組的3倍(P<0.05)；P+U+M組轉(zhuǎn)染率為40.60±8.80％較之P+U組(12.60±3.25％)顯著增高(P=0.001)。 結(jié)論：超聲介導(dǎo)微泡造影劑破裂造成的脊斜肌組織毛細(xì)血管通透性的

8、增加，是血管內(nèi)基因成功跨越內(nèi)膜屏障的主要途徑之一。 第三部分：評價超聲聯(lián)合白蛋白微泡造影劑實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染靶向性的研究 目的：評價超聲聯(lián)合白蛋白微泡造影劑實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染的靶向性。 方法：選擇增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒為報告基因，經(jīng)股靜脈輸入黏附質(zhì)粒的白蛋白微泡的同時在大鼠背部脊斜肌區(qū)域經(jīng)皮輔予一定強(qiáng)度的超聲照射對大鼠脊斜肌行基因轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染7d后，取脊斜肌、肝、腎、心肌組織快速冷凍切片，熒光顯微鏡下觀察各組織內(nèi)的熒光表達(dá)。